蜈蚣草砷富集的分子機制研究進展

陳焱山，賈夢茹，曹 越，馬奇英

（南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京210023）

砷（Arsenic,As）是一種在自然界中廣泛存在的化學(xué)元素，其所導(dǎo)致的砷污染是全球范圍內(nèi)最常見的重金屬污染之一。砷在環(huán)境中多以無機砷形式存在，常見的無機砷有五價砷酸鹽[Arsenate,As（Ⅴ）]和三價亞砷酸鹽[Arsenite,As（Ⅲ）][1]。As（Ⅴ）主要存在于透氣性良好的有氧土壤中[2]，而As（Ⅲ）主要存在于水淹的還原環(huán)境[3]。美國毒物和疾病登記署（ATSDR）一直將砷列為危害人體健康的化學(xué)品毒物的首位，而國際癌癥組織（IARC）則將無機砷列為人類Ⅰ類致癌物。在我國，砷是環(huán)保部五大重點監(jiān)控的金屬元素之一。2014年，原環(huán)保部和國土資源部聯(lián)合發(fā)布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，我國土壤砷的點位超標(biāo)率高達2.7%。砷容易被農(nóng)作物吸收并在作物可食用部分累積，并通過食物鏈危害人體健康[4-5]。目前，我國部分地區(qū)的砷污染已嚴(yán)重威脅到糧食安全和人體健康，成為制約當(dāng)?shù)厣鐣?jīng)濟發(fā)展的瓶頸之一。

植物修復(fù)是當(dāng)前最為經(jīng)濟有效的砷污染土壤修復(fù)技術(shù)之一，它主要依托砷超富集植物的超積累特性實現(xiàn)砷的容納和轉(zhuǎn)移，以達到凈化土壤的目的，具有成本低、操作簡單、對環(huán)境擾動較小等優(yōu)點[6]。蜈蚣草（Pteris vittata）是世界上第一種被發(fā)現(xiàn)的砷超富集植物，具有極強的砷吸收能力、高效的砷轉(zhuǎn)運富集能力以及植物細胞對砷的高度抗性，因此是一種極為理想的修復(fù)土壤砷污染的植物[7-8]。蜈蚣草屬鳳尾蕨科鳳尾蕨屬多年生草本植物，在我國自然分布于秦嶺以南[9]。研究表明，蜈蚣草在高砷污染土壤中仍可生長，其地上部富集砷的濃度最高可超過干重的2%[7]。目前，蜈蚣草已被廣泛用于砷污染土壤的植物修復(fù)實踐，同時結(jié)合刈割、施肥、水分管理、菌劑使用及輔助劑添加等措施，取得了一定的修復(fù)效果[10-11]。

目前國內(nèi)外對蜈蚣草研究已15年有余，從環(huán)境化學(xué)、植物生理學(xué)、生物化學(xué)等多方面開展了大量蜈蚣草富砷機理的研究，近年來在其砷代謝的分子機制研究方面也取得了一定的進展。相關(guān)研究對于認(rèn)識蜈蚣草的富砷機制，提高植物修復(fù)效率，推動植物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展提供了重要的理論基礎(chǔ)。

1 As（Ⅴ）的吸收

在有氧的土壤中，砷主要以As（Ⅴ）的形式存在，蜈蚣草根際砷的形態(tài)也以As（Ⅴ）為主。作為磷酸鹽（Pi）的類似物，As（Ⅴ）通過Pi的吸收系統(tǒng)進入植物，因此在植物吸收過程中二者表現(xiàn)出顯著的競爭抑制[12-13]。近年來，大量的分子證據(jù)證明As（Ⅴ）通過磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白Pht（Phosphate transporter）被植物吸收，例如，擬南芥中的Pht1；1和Pht1；4、水稻中的OsPht1；4、OsPht1；8等高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白均介導(dǎo)了植物對As（Ⅴ）的吸收[14-16]。在一般植物中，這些為As（Ⅴ）和Pi所共用的Pht對Pi的親和力遠高于As（Ⅴ）[17-18]。

與非砷超富集植物不同，蜈蚣草對As（Ⅴ）的吸收極為高效[19]，但相同的是，蜈蚣草中As（Ⅴ）和Pi的吸收也表現(xiàn)出顯著的拮抗作用和吸收競爭抑制[19-20]，暗示蜈蚣草也是通過Pht吸收As（Ⅴ）。最近，DiTusa等[21]從蜈蚣草中克隆得到了3個磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因：PvPht1；1、PvPht1；2和PvPht1；3。PvPht1；3定位于細胞質(zhì)膜上，轉(zhuǎn)錄水平表達受As（Ⅴ）誘導(dǎo)；在酵母自身磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白缺失突變株P(guān)AM2（Δpho84Δpho89）中表達PvPht1；3，發(fā)現(xiàn)PvPht1；3可以完全回補PAM2對磷的吸收缺陷，并導(dǎo)致酵母砷吸收積累量增加，對As（Ⅴ）也更敏感，這些結(jié)果表明PvPht1；3對Pi和As（Ⅴ）均具有轉(zhuǎn)運能力[21]。進一步研究表明，與一般Pht對Pi的親和力遠高于As（Ⅴ）不同，PvPht1；3對As（Ⅴ）的親和力與其對Pi的親和力相當(dāng)，較低濃度的As（Ⅴ）即可顯著抑制酵母中PvPht1；3對Pi的吸收[21]。這一結(jié)果表明，PvPht1；3是一個高親和的As（Ⅴ）轉(zhuǎn)運蛋白，很可能參與了蜈蚣草根系對As（Ⅴ）的高效吸收[21]。目前，對于PvPht1；3的功能研究還限于酵母系統(tǒng)，其在植物中的功能還有待進一步驗證。

PvPht1；1和PvPht1；2基因編碼蛋白的相似性為98.5%[21]，僅存在個別氨基酸差異。與PvPht1；3不同，PvPht1；1/2的轉(zhuǎn)錄水平表達不受As（Ⅴ）誘導(dǎo)，其在酵母突變體中也不能完全回補PAM2酵母的磷吸收功能缺失所導(dǎo)致的生長抑制，表明其在酵母中對Pi的轉(zhuǎn)運能力較PvPht1；3弱[21]。為深入研究PvPht1；1/2的功能，Cao等[22]進一步將PvPht1；2基因?qū)霟煵?，發(fā)現(xiàn)PvPht1；2編碼一個有功能的磷轉(zhuǎn)運蛋白，可有效提高轉(zhuǎn)基因煙草對磷的吸收和轉(zhuǎn)運，并顯著促進煙草生長，但并不會提高煙草對As（Ⅴ）的吸收，暗示PvPht1；2可能是沒有As（Ⅴ）轉(zhuǎn)運能力的Pi轉(zhuǎn)運蛋白，推測其在蜈蚣草中并未參與As（Ⅴ）的吸收，但參與了蜈蚣草對磷的吸收和轉(zhuǎn)運[22]。目前，對蜈蚣草中不同Pht的功能及其調(diào)控機制進行研究將有助于進一步了解蜈蚣草高效吸收As（Ⅴ）的分子機制，而不同Pht對Pi和As（Ⅴ）的相對選擇性也將是研究的重點。

2 As（Ⅲ）的吸收

在蜈蚣草生長的土壤環(huán)境中，As（Ⅲ）并不是主要的砷賦存形態(tài)，但由于根際微生物的還原作用以及植物根系的生物化學(xué)作用，蜈蚣草根際仍有可能存在一定比例的As（Ⅲ）[23-25]。植物通過水通道蛋白吸收As（Ⅲ）[26]。植物水通道蛋白包括NIPs（Nodulin 26-like intrinsic proteins）、PIPs（Plasma membrane intrinsic proteins）、TIPs（Tonoplast intrinsic proteins）等亞家族，其中NIPs是植物中最主要的As（Ⅲ）吸收蛋白[27-30]。此外，水稻中的部分PIPs也被證實具有As（Ⅲ）透性[31]。在蜈蚣草中，He等[32]挖掘得到了一個TIP類水通道蛋白PvTIP4；1，并發(fā)現(xiàn)其可能參與蜈蚣草對As（Ⅲ）的吸收，這也是植物中被發(fā)現(xiàn)的第一個參與As（Ⅲ）吸收的TIP類水通道蛋白。蜈蚣草中其他水通道蛋白，尤其是NIPs，目前還未見報道。

3 As（Ⅴ）的還原

As（Ⅴ）被普通植物根部吸收后，大部分會被還原為As（Ⅲ），并與谷胱甘肽（GSH）、植物絡(luò)合素（Phyto-chelatins,PCs）等結(jié)合，從而降低砷的毒性[33-34]。在蜈蚣草中，植物組織砷形態(tài)分析表明，大部分As（Ⅴ）被吸收后也還原為As（Ⅲ）[7]。但與非超富集植物不同，蜈蚣草中As（Ⅲ）多以自由狀態(tài)存在于細胞內(nèi)，很少與植物絡(luò)合素形成復(fù)合物[35]。

As（Ⅴ）處理條件下，蜈蚣草根部和地上部As（Ⅲ）的比例并不相同，地上部As（Ⅲ）比例較高（50%～90%），而根部一般以As（Ⅴ）為主，As（Ⅲ）比例一般為 10%～40%[7,36-38]。Duan等[39]發(fā)現(xiàn)，蜈蚣草根系提取物能將As（Ⅴ）還原為As（Ⅲ），但地上部羽葉提取物則不能，證明了蜈蚣草中砷酸還原酶的存在，并暗示羽葉中As（Ⅲ）可能來自于根系中As（Ⅴ）的還原。但是，蜈蚣草羽葉在As（Ⅴ）處理條件下也能通過葉片吸收As（Ⅴ）并將其還原為As（Ⅲ），說明蜈蚣草羽葉中也存在As（Ⅴ）的還原[40-41]。蜈蚣草地上部羽葉中As（Ⅲ）比例較根部As（Ⅲ）比例高，則有可能是根部As（Ⅴ）還原為As（Ⅲ）后被高效地轉(zhuǎn)運至地上部所致[42]。

在真核模式生物釀酒酵母（Saccharomyces cere?visiae）中，ACR2砷酸還原酶介導(dǎo)了As（Ⅴ）的還原，也是酵母砷解毒的第一步[43]。在植物中，植物的ACR2砷酸還原酶，如擬南芥AtACR2以及水稻OsACR2.1、OsACR2.2等均被認(rèn)為是砷代謝的關(guān)鍵酶，介導(dǎo)了As（Ⅴ）的還原[44-45]。Ellis等[46]在蜈蚣草中也克隆得到了PvACR2，并發(fā)現(xiàn)其介導(dǎo)As（Ⅴ）的還原。研究表明，PvACR2具有和酵母ACR2相似的砷酸還原酶活性，能將As（Ⅴ）還原成As（Ⅲ），且它在蜈蚣草中的表達不受外界砷濃度的調(diào)控[46]。很多重金屬超富集植物都有一個共同的特點，即重金屬代謝關(guān)鍵基因不受該重金屬誘導(dǎo)且能持續(xù)高水平表達，這也暗示了PvACR2在蜈蚣草砷富集過程中起重要作用[46]。

隨著對植物砷酸還原酶研究的深入，一些證據(jù)顯示，ACR2可能并非植物砷還原的關(guān)鍵酶，ACR2的功能缺失并不影響植物中砷的氧化還原、抗性或積累特性[47-48]。另外，植物中一類新的砷酸還原酶被發(fā)現(xiàn)，這類名為HAC1（High Arsenic Content 1）或ARQ1（Arsenate Reductase QTL1）的砷酸還原酶不屬于ACR2[48-49]。在擬南芥中，HAC1介導(dǎo)了擬南芥根部外皮層中As（Ⅴ）的還原，從而促進植物根中As（Ⅲ）的外排。HAC1的功能缺失則導(dǎo)致As（Ⅴ）還原受阻，As（Ⅲ）外排減少，砷轉(zhuǎn)運的增加以及植株對As（Ⅴ）的耐性降低[48]。在水稻中，OsHAC1；1、OsHAC1；2和OsHAC1；4均被認(rèn)為介導(dǎo)了As（Ⅴ）的還原，超表達這些基因顯著增強了水稻對As（Ⅴ）的抗性，增加了水稻根系A(chǔ)s（Ⅲ）的外排并降低了水稻砷積累[50-51]。目前，蜈蚣草中是否存在HAC1砷酸還原酶尚不清楚。由于植物ACR2在砷還原中的作用和功能存在疑問，且最新證據(jù)都表明HAC1在植物砷還原和砷代謝中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，這為研究蜈蚣草砷酸還原酶提出了新的思考。

4 砷的外排

在釀酒酵母中，As（Ⅲ）逆轉(zhuǎn)運蛋白ACR3能利用質(zhì)子泵提供驅(qū)動力將酵母細胞中的As（Ⅲ）外排至胞外，是酵母細胞實現(xiàn)砷解毒最重要的途徑之一[52]。與釀酒酵母類似，植物中也存在砷的外排現(xiàn)象。當(dāng)As（Ⅴ）被植物的根系吸收后，一部分砷會被植物還原成As（Ⅲ）并以As（Ⅲ）的形式重新外排到外界環(huán)境中[53]。植物根系A(chǔ)s（Ⅲ）的外排在一定程度上降低了植物對砷的吸收，可能是砷解毒的方式之一。目前，植物根部As（Ⅲ）的外排在很多植物中都被證實，這些植物在較低濃度、較短時間As（Ⅴ）處理時就表現(xiàn)出顯著的As（Ⅲ）外排[53-54]。與普通植物根部較強的As（Ⅲ）外排不同，在蜈蚣草中，低砷處理時根部As（Ⅲ）外排較弱，這在一定程度上解釋了蜈蚣草對砷高效的吸收[42]。此外，蜈蚣草在高砷處理時也會表現(xiàn)出較強的As（Ⅲ）外排，推測可能與高砷脅迫下的砷解毒有關(guān)[55]。

5 羽葉中砷的液泡區(qū)隔化

蜈蚣草將大量砷富集在地上部羽葉中，通過EDXA（Energy Dispersive X-ray Analyses）技術(shù)和XAS（X-ray Absorption Spectroscopy）原位觀測砷的亞細胞分布，發(fā)現(xiàn)砷可能主要儲存在液泡中[36,38]；而通過細胞組分和液泡分離分析，也進一步證實被蜈蚣草吸收的砷主要儲存在羽葉液泡中，推測砷在羽葉中的液泡區(qū)隔化是蜈蚣草砷超富集的關(guān)鍵[56-57]。

前文提到，ACR3在酵母中可將細胞中的As（Ⅲ）外排至外界環(huán)境中，這對微生物砷解毒至關(guān)重要[52,58]。相對于微生物，關(guān)于植物ACR3亞砷酸逆轉(zhuǎn)運蛋白的功能研究十分匱乏，這主要是因為在植物進化的過程中，ACR3在顯花植物（被子植物）中丟失，僅在苔蘚、蕨類等植物中存在[59]。2010年，蜈蚣草中ACR3基因PvACR3被克隆得到，該基因沉默會導(dǎo)致蜈蚣草配子體對As（Ⅲ）敏感[59]。通過純化質(zhì)膜以及液泡膜并進行蛋白免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，PvACR3蛋白與液泡膜共提取，推測PvACR3定位在蜈蚣草細胞液泡膜上，暗示PvACR3將As（Ⅲ）泵到液泡中進行區(qū)隔化并實現(xiàn)蜈蚣草對砷的解毒和積累[59]。蜈蚣草另一個ACR3基因PvACR3；1與PvACR3同時被發(fā)現(xiàn)，但該基因在當(dāng)時并未被克隆得到，因此功能未知[59]。Chen等[60]將PvACR3；1導(dǎo)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)PvACR3；1在擬南芥中定位于液泡膜上。因此PvACR3；1也有可能介導(dǎo)蜈蚣草中As（Ⅲ）的液泡區(qū)隔化。

6 砷的木質(zhì)部轉(zhuǎn)運

從根部向地上部高效的砷轉(zhuǎn)運是蜈蚣草區(qū)別于非砷超富集植物的最主要特征之一。在非砷超富集植物中，砷多滯留在根部而不能有效地轉(zhuǎn)運至地上部，其砷的轉(zhuǎn)運系數(shù)一般小于1，而蜈蚣草的高效砷轉(zhuǎn)運可使地上部的砷含量遠高于根部，也遠高于土壤中的砷濃度。前文提到，蜈蚣草根中砷很少與植物絡(luò)合素形成復(fù)合物，大部分砷以自由態(tài)形式存在，As（Ⅲ）外排較弱，這些都是根部As（Ⅲ）被高效轉(zhuǎn)運至地上部的重要原因[42]。

此前，研究人員對砷轉(zhuǎn)運的分子機制并不清楚。近年來，隨著對蜈蚣草ACR3的進一步研究，發(fā)現(xiàn)蜈蚣草中的ACR3基因有可能參與了蜈蚣草根部砷向木質(zhì)部中的高效裝載和轉(zhuǎn)運[61-62]。Indriolo等[59]在報道蜈蚣草ACR3時指出，PvACR3定位在蜈蚣草細胞液泡膜上，是介導(dǎo)砷在羽葉中液泡區(qū)隔化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白。但Indriolo等[59]同時也指出，在As（Ⅴ）處理條件下生長的蜈蚣草孢子體根部PvACR3轉(zhuǎn)錄水平的表達量是羽葉中表達量的15倍。如果PvACR3定位于液泡膜上，且在孢子體根部大量表達，可能會導(dǎo)致大量的砷被滯留在根部液泡中，從而不能實現(xiàn)砷從根部向地上部分的高效轉(zhuǎn)移。這與蜈蚣草高效的砷轉(zhuǎn)移效率以及羽葉中砷濃度較高、根部砷濃度較低的生物學(xué)特性是相悖的。此外，Indriolo等在討論中也指出，ACR3除了介導(dǎo)As（Ⅲ）向液泡中的運輸之外，也可能介導(dǎo)根部As（Ⅲ）向木質(zhì)部的裝載和運輸[59]。由此，PvACR3定位于蜈蚣草液泡膜上并介導(dǎo)砷在羽葉中的區(qū)隔化的結(jié)論可能并不準(zhǔn)確或并不全面。

Chen等[61]將PvACR3導(dǎo)入模式植物擬南芥中進行表達，發(fā)現(xiàn)表達PvACR3能顯著提高擬南芥對砷的抗性，促進擬南芥根系及地上部分在砷脅迫條件下的生長。PvACR3-GFP融合蛋白的熒光定位表明，PvACR3定位于細胞的質(zhì)膜上。同時研究還發(fā)現(xiàn)表達PvACR3能顯著增加As（Ⅴ）脅迫條件下植物根部向外界培養(yǎng)基中As（Ⅲ）的外排，從而降低植物根部的砷含量；與此同時，在As（Ⅲ）和As（Ⅴ）處理條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的砷轉(zhuǎn)運系數(shù)均顯著高于野生型，部分處理條件下地上部的砷含量甚至顯著高于野生型對照，暗示PvACR3可能介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因擬南芥中As（Ⅲ）向地上部的轉(zhuǎn)運[61]。Wang等[62]也發(fā)現(xiàn)，PvACR3在擬南芥中定位于細胞質(zhì)膜上，其異源表達能顯著增加擬南芥對砷的抗性，但并未增加擬南芥根部As（Ⅲ）的外排。此外，異源表達PvACR3極顯著促進了擬南芥對砷的轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致擬南芥地上部的砷含量顯著升高，在 5 μmol·L-1As（Ⅲ）或5 μmol·L-1As（Ⅴ）條件下處理2 d，擬南芥地上部砷較野生型對照分別增加25～34倍和29～37倍[62]。這些結(jié)果均表明，PvACR3介導(dǎo)了植物As（Ⅲ）的轉(zhuǎn)運，暗示其在蜈蚣草As（Ⅲ）的木質(zhì)部裝載和轉(zhuǎn)運過程中也發(fā)揮了關(guān)鍵作用[61-62]。

7 展望

蜈蚣草是一種生長緩慢的多年生蕨類植物，基因組較大且遺傳背景不清楚，缺少有效的轉(zhuǎn)基因手段或基因敲除手段直接研究相關(guān)基因在蜈蚣草中的功能和作用機制。盡管Indriolo等[59]利用基因槍轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因的蜈蚣草配子體，但是僅在蜈蚣草中實現(xiàn)了基因的瞬時表達。此外，Muthukumar等[63]以孢子為轉(zhuǎn)化受體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化植株,但目前缺少實際轉(zhuǎn)化成功案例的支持，而且蜈蚣草存在明顯的世代交替，生活周期漫長，在實際研究中轉(zhuǎn)化并獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因蜈蚣草目前在操作上仍不可行。這些限制因素導(dǎo)致在蜈蚣草基因挖掘和分子機制方面的研究進展仍較為緩慢，明顯落后于模式植物擬南芥和水稻中砷代謝的相關(guān)研究。

展望未來蜈蚣草的分子機制研究，可從以下幾個方面開展工作：（1）利用高通量測序（包括基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序等）獲取關(guān)于蜈蚣草更多的基因組、轉(zhuǎn)錄組等遺傳信息，為研究蜈蚣草砷代謝的分子機制提供重要基礎(chǔ)；（2）蜈蚣草高效吸收As（Ⅴ）的關(guān)鍵是磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白Pht，Pht是一個龐大的基因家族，在植物中數(shù)量較多，因此需要挖掘更多的Pht并開展比較研究；（3）模式植物擬南芥和水稻中HAC砷酸還原酶的發(fā)現(xiàn)，為研究蜈蚣草砷代謝中極為重要的砷還原過程及其分子機制提供了重要參考；（4）蜈蚣草ACR3基因在蜈蚣草砷轉(zhuǎn)運、解毒和富集中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其在蜈蚣草中的功能仍有待進一步研究。

蜈蚣草是為數(shù)不多的、成功應(yīng)用于農(nóng)田及耕地砷污染的超富集植物。田間試驗表明，在砷濃度為60～70 mg·kg-1的污染土壤中，通過合理施肥，在種植蜈蚣草7個月后，土壤中砷含量可下降5.0 mg·kg-1,土壤修復(fù)效率可達7.8%[64]。2014年，中科院地理資源所在湖南石門縣白云鄉(xiāng)啟動“南方土壤重金屬污染風(fēng)險區(qū)劃與修復(fù)技術(shù)研發(fā)示范”，經(jīng)過2年修復(fù)，土壤砷含量降低了13.6%，為我國砷污染地區(qū)提供了重要的修復(fù)工程示范[65]。蜈蚣草具有很高的應(yīng)用價值，也具有很高的科研價值，深入挖掘其砷代謝關(guān)鍵基因，探究蜈蚣草砷富集的分子機制，可為科學(xué)高效地利用蜈蚣草開展植物修復(fù)提供理論支撐，為培育砷污染修復(fù)工程植物提供重要的基因資源。