植物分子遺傳學(xué)在挖掘作物重金屬積累相關(guān)基因中的作用

黃新元，趙方杰

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

隨著我國(guó)工業(yè)化、城市化的快速發(fā)展，土壤重金屬污染問(wèn)題日益突出。2014年原環(huán)保部和原國(guó)土資源部發(fā)布了全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查報(bào)告，報(bào)告指出我國(guó)耕地土壤點(diǎn)位污染物含量超標(biāo)率達(dá)19.4%，其中重金屬鎘和類金屬砷的超標(biāo)率分別為7%和2.7%，污染程度以中、低污染為主[1]。由于農(nóng)田重金屬污染造成的農(nóng)產(chǎn)品重金屬超標(biāo)時(shí)常發(fā)生，其中以我國(guó)南方稻米重金屬含量超標(biāo)尤為嚴(yán)重[2]。根據(jù)Du等[3]和Zhu等[4]的調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)湖南益陽(yáng)地區(qū)和長(zhǎng)株潭地區(qū)分別有60%和76%的稻米鎘含量超過(guò)我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中稻米鎘限量值（0.2 mg·kg-1），其中樣品最高含量甚至超過(guò)限量值的24倍。湖南和廣東地區(qū)受采礦影響的稻田稻米砷含量超標(biāo)率也達(dá)到50%[5]。由于土壤重金屬的污染造成農(nóng)產(chǎn)品重金屬含量升高，已經(jīng)導(dǎo)致了我國(guó)居民鎘的攝入量逐年增加。我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)對(duì)我國(guó)居民人均每天鎘的攝入量進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)25年的調(diào)查，結(jié)果顯示我國(guó)居民人均每天鎘的攝入量已從1990年的13.8 μg·d-1上升到了2015年的30.6 μg·d-1，25年間升高了122%，達(dá)到了世界衛(wèi)生組織和世界糧農(nóng)組織規(guī)定的日均鎘允許攝入量的61%[6]。對(duì)居民膳食來(lái)源分析表明，稻米是我國(guó)居民膳食中鎘的主要來(lái)源，占人均每天鎘攝入量的55%，其中在南方人群中則占到了65%[6]。因此，由于農(nóng)田重金屬污染造成的農(nóng)產(chǎn)品重金屬超標(biāo)已對(duì)我國(guó)居民身體健康構(gòu)成了威脅，成為限制我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要因素。

為保障農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地可持續(xù)利用及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，2016年國(guó)務(wù)院發(fā)布了《土壤污染防治行動(dòng)計(jì)劃》，提出了到2020年和2030年，受污染耕地安全利用率分別達(dá)到90%左右和95%以上的指標(biāo)。然而，由于我國(guó)農(nóng)田重金屬污染范圍較廣、形態(tài)類型復(fù)雜，污染耕地的治理將是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程。同時(shí)為了保持糧食總產(chǎn)量和保住18億畝（1.2億hm2）耕地的底線，我國(guó)很多重金屬中、低度污染農(nóng)田仍繼續(xù)從事高強(qiáng)度的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，導(dǎo)致類似“鎘大米”等農(nóng)產(chǎn)品重金屬超標(biāo)事件頻繁發(fā)生。因此，在這種國(guó)情下，研發(fā)阻控作物重金屬積累的策略，保證農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全和污染農(nóng)田的安全利用，已成為我國(guó)目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的當(dāng)務(wù)之急。

對(duì)于重金屬中、低程度污染的農(nóng)田，降低農(nóng)產(chǎn)品重金屬污染最有效并可以持久的策略是通過(guò)遺傳改良和基因工程方法培育重金屬低積累的作物品種，阻控重金屬向可食部位的轉(zhuǎn)運(yùn)。而這一策略的實(shí)現(xiàn)需要建立在植物分子遺傳學(xué)的方法上克隆與重金屬吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累等相關(guān)的功能基因，并且在系統(tǒng)、深入了解作物重金屬積累的分子遺傳調(diào)控機(jī)理的基礎(chǔ)上。本文將在介紹常用基因定位克隆方法的基礎(chǔ)上，以目前已經(jīng)克隆的控制水稻吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累鎘的相關(guān)基因?yàn)槔?，介紹如何通過(guò)分子遺傳學(xué)的方法克隆這些基因，并對(duì)這些基因控制重金屬積累的分子遺傳機(jī)理進(jìn)行闡述，同時(shí)展望這些基因在培育重金屬低積累品種中的應(yīng)用前景。

1 定位克隆控制重金屬積累相關(guān)基因的常用方法

常用的定位和克隆控制作物重金屬積累相關(guān)基因的方法主要有同源克隆和QTL（數(shù)量性狀位點(diǎn)）定位方法。其中QTL定位包括連鎖分析法和關(guān)聯(lián)分析法等。

1.1 同源克隆

同源克隆的方法主要基于模式物種中已知具有控制重金屬吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)等功能的基因，根據(jù)這些基因的序列信息在作物中尋找與該基因序列保守的同源基因或者基因家族。然后將這些基因在作物中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，或者通過(guò)RNA干涉（RNAi）、CRISPR/Cas9基因編輯等技術(shù)將這些基因的表達(dá)量降低或?qū)⒒蜻M(jìn)行敲除，考察轉(zhuǎn)基因植株是否出現(xiàn)重金屬吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累等表型的變化，從而明確這些同源基因是否具有控制作物重金屬吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累的功能。同源克隆的方法主要用于早期沒(méi)有基因組信息的農(nóng)作物，利用細(xì)菌、酵母等低等生物以及擬南芥等模式植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的控制重金屬吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因，在水稻、小麥和玉米等基因組中尋找相關(guān)基因的同源基因。同源克隆的方法是從“基因”到“表型”，因此是一種反向遺傳學(xué)的方法。隨著作物基因組信息逐步完善，基因組上許多基因的功能都被注釋。根據(jù)基因注釋的功能，結(jié)合基因的表達(dá)模式，如在根內(nèi)皮層或者節(jié)的維管束細(xì)胞特異表達(dá)等信息，挑選與重金屬積累相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行過(guò)量表達(dá)或者基因敲除等，研究它們是否出現(xiàn)重金屬積累相關(guān)表型，是目前通過(guò)反向遺傳學(xué)克隆重金屬積累相關(guān)基因的常用手段。

1.2 QTL定位與基因克隆

作物重金屬含量是呈現(xiàn)連續(xù)變異的性狀，因此屬于數(shù)量性狀。與其他農(nóng)藝數(shù)量性狀一樣，作物重金屬含量大都由多個(gè)數(shù)量性狀基因位點(diǎn)（QTL）所控制。QTL定位的基本原理是通過(guò)建立適當(dāng)?shù)姆蛛x群體，發(fā)展分布較均勻的、覆蓋全基因組的、具有多態(tài)性的分子標(biāo)記，構(gòu)建密度較高的分子標(biāo)記連鎖圖譜。然后利用分子標(biāo)記對(duì)分離群體中的每個(gè)單株進(jìn)行基因型鑒定，同時(shí)測(cè)定各單株的重金屬含量等表型，隨后對(duì)單株的標(biāo)記基因型和性狀的表型值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從而確定控制重金屬含量相關(guān)QTL位點(diǎn)在分子標(biāo)記連鎖圖中的位置。通過(guò)QTL定位分析，可以獲得控制重金屬含量的基因位于基因組上的初步位置，進(jìn)一步通過(guò)精細(xì)定位和轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，最終克隆到相應(yīng)的基因。QTL定位主要涉及到定位群體的構(gòu)建、分子標(biāo)記的研發(fā)、遺傳圖譜的構(gòu)建和進(jìn)行連鎖分析或者關(guān)聯(lián)分析。

用于定位控制重金屬積累相關(guān)QTL的定位群體主要有F2群體、重組自交系群體（RIL群體）、導(dǎo)入系群體（IL群體）、雙單倍體群體（DH群體）和自然品系群體。F2群體是由兩個(gè)親本雜交后獲得F1，將F1自交后所構(gòu)建的群體。由于F2群體的下一代還會(huì)繼續(xù)分離，因此是一種臨時(shí)性群體，主要應(yīng)用于突變體和重金屬極端積累品種的初步定位。RIL群體是在F2群體的基礎(chǔ)上，對(duì)下一代的每個(gè)株系隨機(jī)選擇一粒種子自交，連續(xù)進(jìn)行多代自交獲得的高世代單株，一般要自交到6代以上，其大部分基因組序列已經(jīng)純合，各染色體融合了雙親的片段。與RIL群體不同，IL群體在通過(guò)雙親雜交之后與其中一個(gè)親本（受體親本）進(jìn)行多代回交，同時(shí)每一代都對(duì)各單株進(jìn)行基因型鑒定，挑選染色體特定片段為其中一個(gè)親本（供體親本），而基因組其他位置為受體親本，最終獲得的IL群體覆蓋了供體親本的全基因組，群體中每個(gè)株系帶有供體親本基因組的不同染色體片段，而背景與輪回親本相同。與RIL群體相比，IL群體由于具有一致的遺傳背景，因此具有可以檢測(cè)QTL間的上位效應(yīng)、QTL定位靈敏度更高等優(yōu)點(diǎn)。RIL群體和IL群體都需要經(jīng)過(guò)多代的自交或者雜交，因此構(gòu)建通常耗時(shí)很長(zhǎng)。DH群體是由兩個(gè)親本雜交獲得F1后，將F1通過(guò)花藥組培將單倍體花粉經(jīng)過(guò)人工加倍形成二倍體成苗，從而將F1雜合基因組固定為純合，大幅縮短了群體構(gòu)建的時(shí)間。與F2群體的后代還需繼續(xù)分離不同，RIL群體、IL群體和DH群體的單株基因組基本純合，下一代基因型基本不再分離，因此是永久性定位群體。自然群體則由不同的品種構(gòu)成，這些品種從種質(zhì)資源中根據(jù)品種間親緣關(guān)系進(jìn)行選擇，一般用于全基因組關(guān)聯(lián)分析。

構(gòu)建好定位群體后，在測(cè)定各株系重金屬含量進(jìn)行表型鑒定的同時(shí)，需要利用分子標(biāo)記對(duì)群體中的各株系進(jìn)行基因型分析。早期常用的分子標(biāo)記主要有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（AFLP）和酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列標(biāo)記（CAPS）等。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，目前常用的是單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（SNP）。與上述標(biāo)記相比，SNP標(biāo)記在基因組上存在的數(shù)量更為豐富。在對(duì)群體各株系進(jìn)行基因型鑒定之后，根據(jù)各分子標(biāo)記之間的交換頻率，確定它們?cè)谌旧w上的位置，即構(gòu)建分子遺傳圖譜?；诜肿舆z傳圖譜，將各株系的表型與基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，即QTL定位分析。QTL分析主要分為連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析，前者可以分為單標(biāo)記分析法、區(qū)間作圖法和復(fù)合區(qū)間作圖法等，而后者則基于連鎖不平衡，將全基因組的SNP標(biāo)記與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）是最近十幾年來(lái)興起的QTL定位分析方法，主要利用到具有遺傳多樣性較高的自然群體。與基于雙親的連鎖分析不同，GWAS利用的是數(shù)百個(gè)品種構(gòu)成的自然群體，遺傳多樣性更加豐富。同時(shí)由于GWAS采用的是覆蓋全基因組的高密度SNP標(biāo)記，QTL定位的精度通常要比連鎖分析高很多。目前，通過(guò)GWAS對(duì)重金屬含量進(jìn)行QTL定位已經(jīng)有不少報(bào)道[7-9]。

2 定位克隆控制重金屬積累相關(guān)基因的實(shí)例

目前在水稻等農(nóng)作物中已經(jīng)克隆出了多個(gè)控制重金屬積累的相關(guān)基因。本研究以重金屬鎘為例，介紹如何通過(guò)分子遺傳學(xué)的方法定位和克隆控制水稻鎘吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配的三個(gè)基因：OsNRAMP5、OsH?MA3和CAL1。

2.1 定位克隆控制水稻根部鎘吸收的OsNRAMP5基因

水稻主要是通過(guò)根系從土壤中吸收鎘，大氣沉降的鎘通過(guò)葉片吸收占籽粒鎘的積累貢獻(xiàn)非常小。因此，通過(guò)控制水稻根系鎘的吸收可以有效減少鎘在籽粒的積累。在水稻中，鎘主要是通過(guò)錳和鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsNRAMP5進(jìn)行吸收，由兩個(gè)日本研究所團(tuán)隊(duì)采用完全不同的方法獨(dú)立發(fā)現(xiàn)[10-11]。Sasaki等[10]采用的是反向遺傳的方法，并對(duì)OsNRAMP5的作用機(jī)制進(jìn)行了深入的研究；而Ishikawa等[11]則通過(guò)正向遺傳學(xué)的方法克隆到了OsNRAMP5基因，該研究通過(guò)輻射誘變獲得的osnramp5突變體可以應(yīng)用于低鎘水稻育種。NRAMP基因編碼的是天然免疫力相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白，最先是在哺乳動(dòng)物中被克隆[12]。隨后研究表明NRAMP蛋白家族具有轉(zhuǎn)運(yùn)錳、鎘、鐵、銅和鋅等二價(jià)陽(yáng)離子的活性。模式植物擬南芥和水稻中分別有6個(gè)和7個(gè)NRAMP基因，其中擬南芥的AtNRAMP1、At?NRAMP2和AtNRAMP4均具有轉(zhuǎn)運(yùn)錳、鎘、鐵的活性，而AtNRAMP6只特異轉(zhuǎn)運(yùn)鎘[12-17]。在水稻中，OsN?RAMP1具有轉(zhuǎn)運(yùn)鐵和鎘的活性而不具有錳的轉(zhuǎn)運(yùn)活性[16，18]，OsNRAMP6 則具有轉(zhuǎn)運(yùn)三價(jià)鋁離子的活性。為了研究水稻其他OsNRAMP基因的功能，Sasaki等[10]通過(guò)反向遺傳學(xué)的方法，獲得了OsNRAMP5基因T-DNA插入突變體，發(fā)現(xiàn)突變體根部錳、鎘的吸收大幅度降低，其莖葉和籽粒錳、鎘含量也顯著降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)OsNRAMP5蛋白定位在根部的外皮層和內(nèi)皮層細(xì)胞外側(cè)的細(xì)胞膜，負(fù)責(zé)將錳、鎘離子轉(zhuǎn)運(yùn)到根細(xì)胞中。由于OsNRAMP5在錳吸收上起重要作用，在水培條件下osnramp5突變體比野生型對(duì)缺錳更為敏感[10，19]。Ishikawa等[11]則采用正向遺傳學(xué)的方法克隆OsNRAMP5基因，他們將水稻粳稻品種越光進(jìn)行離子束輻射誘變構(gòu)建突變體庫(kù)，通過(guò)對(duì)2592個(gè)突變單株進(jìn)行篩選，獲得了3株籽粒鎘含量降低的突變體。通過(guò)將突變體與秈稻品種Kasalath雜交構(gòu)建F2群體，利用圖位克隆的方法，發(fā)現(xiàn)突變體中OsN?RAMP5基因發(fā)生突變而喪失了功能，從而引起根部鎘的吸收減少，籽粒鎘的含量降低。在不同的大田種植條件下，野生型籽粒鎘的含量為0.6～1.8 μg·g-1，而osnramp5突變體籽粒鎘的含量最高僅為0.03 μg·g-1[11]，顯示了通過(guò)破壞OsNRAMP5基因的功能可以很好地控制鎘在籽粒中的積累。因此，通過(guò)正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)的方法，均克隆到了控制根部鎘吸收的關(guān)鍵基因OsNRAMP5。

2.2 定位克隆控制鎘在水稻根部液泡區(qū)隔化的OsH?MA3基因

鎘離子通過(guò)植物根部吸收進(jìn)入植物體內(nèi)后通常被區(qū)隔化到液泡中。在水稻中這一過(guò)程由P-1B型重金屬ATP酶OsHMA3負(fù)責(zé)[20]。OsHMA3基因是通過(guò)QTL定位克隆到的。Ueno等[21]測(cè)定了146份水稻品種地上部鎘含量，篩選到多份地上部鎘含量極端高的品種。隨后選取高鎘品種Anjana Dhan和低鎘品種日本晴構(gòu)建F2定位群體，將控制高鎘基因定位在水稻7號(hào)染色體上1.9 Mb的范圍內(nèi)[22]。為了進(jìn)一步縮小定位，他們構(gòu)建了包含965個(gè)單株的F2群體，并在定位區(qū)間內(nèi)發(fā)展了新的分子標(biāo)記。利用這些分子標(biāo)記在F2群體中篩選重組交換個(gè)體，通過(guò)對(duì)交換個(gè)體的基因型和表型進(jìn)行分析，最終將高鎘基因定位在159 kb的范圍內(nèi)。通過(guò)對(duì)QTL定位區(qū)間內(nèi)的候選基因進(jìn)行序列測(cè)定、在酵母檢測(cè)鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)活性和轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)等，最終將高鎘基因確定為OsHMA3基因。OsHMA3基因在根部各層細(xì)胞均表達(dá)，其編碼的蛋白定位在液泡膜上，負(fù)責(zé)將鎘轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中儲(chǔ)存。在高鎘品種中，由于OsHMA3基因發(fā)生突變?cè)斐晒δ軉适?，不能將鎘轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中而被轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部和籽粒中，從而出現(xiàn)地上部和籽粒鎘含量升高的表型[20]。利用相同的QTL定位方法，Miyadate等[23]也在高鎘品種Cho-Ko-Koku中克隆到了OsHMA3基因，而且OsHMA3基因在Cho-Ko-Koku和在Anjana Dhan兩個(gè)品種中具有相同的突變位點(diǎn)。事實(shí)上，OsHMA3基因在水稻品種中存在多種功能喪失型的突變形式，都造成了地上部和籽粒鎘含量的升高[24]。由于OsHMA3可以將鎘轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中，而水稻根系中OsHMA3基因表達(dá)量較低，通過(guò)強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)其過(guò)量表達(dá)，可以將鎘截留在根部液泡中，從而減少鎘向地上部的運(yùn)輸和在籽粒的積累。將過(guò)量表達(dá)OsHMA3的轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓攴N植于含有1.5 mg·kg-1鎘的污染土壤中，對(duì)照植株籽粒鎘含量達(dá)到5.5 μg·g-1左右，而轉(zhuǎn)基因植株則只有0.2 μg·g-1左右[20]。因此，過(guò)量表達(dá)OsHMA3與破壞OsRNAMP5基因的功能一樣，都具有很好的控制鎘在籽粒積累的效果。

2.3 定位克隆控制鎘在水稻分配的CAL1基因

雖然通過(guò)破壞OsNRAMP5的功能和過(guò)量表達(dá)OsHMA3可以有效降低籽粒鎘的積累，但是污染農(nóng)田中的鎘仍然滯留于農(nóng)田土壤中。如果能將鎘定向地分配到水稻地上部秸稈等非可食部分，而不向籽粒中積累，既可以保證水稻安全生產(chǎn)，同時(shí)又將通過(guò)秸稈將鎘進(jìn)行移除修復(fù)，這種“修復(fù)型”的水稻品種有望可以實(shí)現(xiàn)重金屬中、低度污染農(nóng)田的“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”。

最近，Luo等[25]在“修復(fù)型”水稻的遺傳基礎(chǔ)解析方面取得了重大進(jìn)展，克隆到了一個(gè)特異調(diào)控鎘在水稻葉片中積累的主效QTL基因CAL1。他們對(duì)212份能較好代表中國(guó)水稻遺傳多樣性的核心種質(zhì)資源和一些代表水稻品種進(jìn)行篩選，鑒定出了鎘高積累的水稻品種臺(tái)南1號(hào)（TN1）。利用TN1和春江06（CJ06）構(gòu)建的雙單倍體群體對(duì)葉片鎘含量進(jìn)行QTL定位分析，定位到3個(gè)分別位于水稻2、4、11號(hào)染色體的QTL位點(diǎn)。隨后他們對(duì)定位在2號(hào)染色體上貢獻(xiàn)率為12%的QTL位點(diǎn)進(jìn)行了精細(xì)定位。通過(guò)將TN1與CJ06進(jìn)行連續(xù)多代回交，獲得了QTL定位區(qū)間攜帶有來(lái)源于TN1的基因組片段，而基因組其他片段均來(lái)源于CJ06的染色體單片段置換系。與TN1一樣，染色體單片段置換系的葉片鎘含量也是高的。通過(guò)染色體單片段置換系與CJ06回交獲得的包含3651單株的回交F3代，將控制葉片鎘含量的基因定位在56 kb的基因組范圍內(nèi)，該區(qū)域內(nèi)僅含有4個(gè)候選基因。通過(guò)轉(zhuǎn)基因?qū)⑦@4個(gè)候選基因分別轉(zhuǎn)到低鎘品種CJ06中，發(fā)現(xiàn)僅其中一個(gè)候選基因CAL1可以提高CJ06葉片鎘的含量，從而證明了CAL1是控制葉片鎘含量的基因。CAL1基因編碼一個(gè)植物防御素類似蛋白，該蛋白定位在細(xì)胞壁上。CAL1基因主要在根的外皮層和中柱木質(zhì)部薄壁細(xì)胞以及劍葉的葉鞘木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中表達(dá)。CAL1蛋白可以通過(guò)其蛋白上的巰基與鎘進(jìn)行螯合，鎘與CAL1結(jié)合之后可以從木質(zhì)部薄壁細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分泌出來(lái)，進(jìn)入木質(zhì)部中參與向地上部的長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)，從而促進(jìn)鎘在葉片的積累。由于鎘與CAL1的緊密結(jié)合，可能影響了螯合態(tài)的鎘再次跨細(xì)胞膜進(jìn)入韌皮部向水稻籽粒的再分配過(guò)程，從而定向調(diào)控鎘在葉片等營(yíng)養(yǎng)器官的積累而不影響籽粒中鎘的積累[25]。因此CAL1基因可以應(yīng)用于培育秸稈鎘高積累而籽粒鎘含量達(dá)標(biāo)的“修復(fù)型”水稻品種，有望實(shí)現(xiàn)重金屬中、低度污染農(nóng)田的“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”。

3 展望

隨著分子遺傳學(xué)、基因組學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，越來(lái)越多與重金屬積累相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)。同時(shí)，隨著包括基因編輯技術(shù)等技術(shù)的興起，這些基因?qū)⒂型麘?yīng)用于培育作物重金屬低積累品種，實(shí)現(xiàn)對(duì)重金屬中、低污染農(nóng)田的安全利用。例如最近通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將兩系雜交稻的兩個(gè)親本華占和隆科638S中的OsNRAMP5基因同時(shí)進(jìn)行敲除，以這兩個(gè)親本組配的雜交稻其籽粒鎘含量比雙親降低了95% 以上[26]。在土壤鎘含量為1.69～2.37 mg·kg-1的污染大田條件下，兩親本籽粒鎘含量超標(biāo)10倍左右，雜交稻的籽粒鎘含量仍然低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)0.2 μg·g-1，表現(xiàn)出很好地控制鎘在籽粒中積累的效果[26]。雖然通過(guò)輻射誘變或者基因編輯的方法都可以破壞OsN?RAM5基因的功能從而降低鎘的吸收，但是OsN?RAMP5同時(shí)也負(fù)責(zé)吸收必需礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素錳[10，27]，并參與體內(nèi)錳從根部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)以及再分配[19]。因此在水培條件osnramp5突變體對(duì)缺錳更為敏感[10，19]，這可能限制了其在低錳農(nóng)田中的應(yīng)用。下一步通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法，解析或者預(yù)測(cè)OsNRAMP5蛋白的三維結(jié)構(gòu)，利用單堿基基因編輯技術(shù)改變蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，從而改變OsNRAMP5蛋白對(duì)金屬離子的選擇性，使其只轉(zhuǎn)運(yùn)錳而不轉(zhuǎn)運(yùn)鎘，這將極大地提高OsNRAMP5基因的應(yīng)用價(jià)值。

另外，過(guò)量表達(dá)OsHMA3同樣可以明顯地降低籽粒鎘的積累[20]。最近克隆的特異定向調(diào)控鎘在葉片等營(yíng)養(yǎng)器官積累的CAL1基因，有望通過(guò)原位過(guò)量表達(dá)等手段，提高鎘在水稻秸稈中富集的同時(shí)保證籽粒鎘含量不超標(biāo)，實(shí)現(xiàn)對(duì)鎘中、低污染農(nóng)田安全利用的同時(shí)對(duì)鎘進(jìn)行移除修復(fù)。上述兩個(gè)基因都需要通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法才能發(fā)揮阻控鎘在籽粒中積累的作用，但目前我們國(guó)家尚未允許種植轉(zhuǎn)基因水稻，這將極大地限制這些基因的應(yīng)用。然而，包括OsHMA3和CAL1在內(nèi)的基因都是水稻基因組中原本就存在的基因，并非外源基因，這些基因在控制鎘積累的機(jī)制也十分清楚，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的低鎘稻米，其食品安全性將會(huì)顯著提升。因此，我們不應(yīng)盲目地排除轉(zhuǎn)基因技術(shù)在培育重金屬低積累品種中的應(yīng)用。通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行敲除，可以在后代中分離得到不含轉(zhuǎn)基因成分而目標(biāo)基因被改造的植株，這應(yīng)該更容易被大眾所接受。

通過(guò)在水稻種質(zhì)資源中挖掘重金屬低積累優(yōu)異等位基因，利用分子標(biāo)記輔助選擇育種的方法培育重金屬低積累品種，是目前阻控重金屬積累的一個(gè)很好的策略。隨著高通量測(cè)序的成本越來(lái)越低，越來(lái)越多的水稻品種基因組被重測(cè)序，基因型的鑒定比以往更為簡(jiǎn)單和準(zhǔn)確。同時(shí)伴隨著離子組學(xué)、表型組學(xué)等學(xué)科的興起，可以對(duì)多種元素進(jìn)行高通量的測(cè)定，使表型的鑒定更為迅速和精確。因此，在種質(zhì)資源中挖掘與重金屬積累相關(guān)的自然變異優(yōu)異等位基因?qū)⒏鼮楸憬?，有望進(jìn)一步通過(guò)全基因組選擇等先進(jìn)的育種手段，培育重金屬低積累水稻新品種，實(shí)現(xiàn)重金屬中、低污染農(nóng)田的安全利用。