乙型副傷寒沙門氏菌在鮮切黃瓜中的生長(zhǎng)行為及預(yù)測(cè)模型建立

, , , ,, ,, , ,青闊,*

(1.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,天津 300381;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所,河北石家莊 050051)

沙門氏菌屬(Salmonellaspp.)是最常見的食源性致病菌之一,其危害范圍大,在肉類食品和魚、禽、奶、蛋類食品中均存在較高風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)估計(jì),美國(guó)每年源于沙門氏菌屬細(xì)菌感染的病例約140萬(wàn),且連續(xù)10年被美國(guó)CDC作為導(dǎo)致食源性疾病爆發(fā)的6類病原微生物監(jiān)測(cè)對(duì)象之一[1-2]。我國(guó)每年由沙門氏菌引起的食物中毒事件在細(xì)菌性食物中毒事件中屢居首位[3-4]。近年來,歐美國(guó)家不斷爆發(fā)即食果蔬和鮮切果蔬被沙門氏菌污染的事件,并逐年呈上升趨勢(shì)[5-6]。生菜、黃瓜、番茄、菠菜、瓜類、豆芽、果蔬沙拉等都曾分離出沙門氏菌[7-8]。

由于我國(guó)食品消費(fèi)和食用方式與歐美等國(guó)家相差較大,大多蔬菜均經(jīng)高溫處理后才食用,所以致病菌污染問題一直未受到重視[9]。但是,隨著人們飲食觀念的逐漸轉(zhuǎn)變,果蔬沙拉、涼拌菜、生食蔬菜等逐漸受到人們的青睞。此類蔬菜一般不經(jīng)過高溫處理,簡(jiǎn)單清洗加工后即可食用。特別是鮮切果蔬在加工過程中由于果蔬表皮組織的破壞,造成鮮切果蔬表面汁液等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的滲出,從而加大了致病菌侵染的風(fēng)險(xiǎn)[10]。鮮切果蔬的特點(diǎn)使其具有較高的安全風(fēng)險(xiǎn)隱患,據(jù)估計(jì),歐洲在2002～2011年間非動(dòng)物性食源性疾病的爆發(fā)則占到了90%，其中由鮮切果蔬引起的占到了第一位[11-12]。

目前,我國(guó)對(duì)即食鮮切果蔬中沙門氏菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的研究較少,主要是生菜、卷心菜、蘋果等有少量研究報(bào)道,偶有蒜苗、香菜、西紅柿、黃瓜、小蔥的研究報(bào)道[13],應(yīng)用微生物預(yù)測(cè)模型可以快速有效地對(duì)病原微生物的生長(zhǎng)、存活和死亡進(jìn)行擬合和預(yù)測(cè),從而確保食品在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯存等風(fēng)險(xiǎn)模塊中的安全性,是一種防止病原微生物對(duì)食品污染并控制其在安全食用水平的有效預(yù)警工具[14-15]。

本研究相對(duì)于前人對(duì)鮮切黃瓜中沙門氏菌的模型構(gòu)建,選取農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)篩查實(shí)驗(yàn)中篩查到黃瓜中的乙型副傷寒沙門氏菌為研究對(duì)象,實(shí)際預(yù)警應(yīng)用性更強(qiáng);同時(shí)模型構(gòu)建擬合溫度范圍選取10～35 ℃下的培養(yǎng)條件,溫度范圍更廣,且包含了沙門氏菌的最適生長(zhǎng)溫度35 ℃,即風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警最高點(diǎn)的溫度;同時(shí)在各個(gè)溫度,參照Combase等相關(guān)軟件,選取了培養(yǎng)時(shí)間更為合理更為精準(zhǔn)的下點(diǎn)測(cè)定時(shí)間,由此在每個(gè)溫度下都能得到沙門氏菌在鮮切黃瓜預(yù)警中的貨架期,因此將能為鮮切黃瓜中沙門氏菌的污染防控提供更為科學(xué)的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

黃瓜 天津市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后于4 ℃冰箱保藏備用;乙型副傷寒沙門氏菌CMCC(B)50094 為本室保藏標(biāo)準(zhǔn)菌株,中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;營(yíng)養(yǎng)肉湯、緩沖蛋白胨水(BPW)培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂(BS)培養(yǎng)基、生化鑒定試劑盒、菌株保藏磁珠等 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;法國(guó)科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基 鄭州博賽生物科技有限公司。

JYD-400型拍擊式均質(zhì)器 上海之信儀器有限公司;SN310C型全自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本三洋有限公司;DRP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒有限公司;HL-200i型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Thermo S1電動(dòng)移液器 美國(guó)熱電公司;ESCO生物安全柜 新加坡藝思高有限公司;CJ-2F超凈工作臺(tái) 蘇州市金燕凈化設(shè)備有限公司;OLYMPUS CX31顯微鏡 德國(guó)奧林巴斯公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 接種液的制備 取沙門氏菌保藏磁珠1粒,接種于100 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中,36 ℃培養(yǎng)18 h,進(jìn)行菌株活化,對(duì)活化后的新鮮菌液進(jìn)行亞硫酸鉍(BS)瓊脂平板計(jì)數(shù),計(jì)算菌液濃度,對(duì)其進(jìn)行適宜梯度稀釋,得到濃度為2×104CFU/mL的沙門氏菌菌液,4 ℃冰箱保藏備用。

1.2.2 樣品處理及本底檢測(cè) 新鮮黃瓜在無菌室用滅菌刀具去皮后切成1 cm3左右的小丁,將其平攤于無菌超凈臺(tái)內(nèi),紫外線下滅菌30 min,再關(guān)閉紫外燈于超凈臺(tái)內(nèi)排風(fēng)30 min,去除紫外殘留。無菌操作分裝為20 g 每份于無菌均質(zhì)袋中,共分裝110袋,置于4 ℃冰箱中備用。同時(shí),隨機(jī)抽取上述分裝樣品2份,分別加入180 mL緩沖蛋白胨水,拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1 min,取0.2 mL涂布于亞硫酸鉍(BS)瓊脂平板表面,36 ℃培養(yǎng)48 h,進(jìn)行黃瓜的本底檢測(cè),本底要求無沙門氏菌生長(zhǎng)。

1.2.3 樣品接種 用無菌吸管吸取1 mL濃度為2×104CFU/mL的沙門氏菌菌液接種至20 g/袋的經(jīng)紫外線下滅菌的黃瓜丁,盡量使其混合均勻,使黃瓜丁的初始帶菌濃度為1×103CFU/g,模擬不同溫度(10、15、20、25、30、35 ℃)進(jìn)行恒溫培養(yǎng),每隔一段時(shí)間,取出樣品,放入 180 mL緩沖蛋白胨水中,拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1 min,用移液器吸取0.2 mL稀釋液涂布于亞硫酸鉍(BS)瓊脂平板,于36 ℃倒置培養(yǎng)48 h后,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.4 應(yīng)用IPMP 2013構(gòu)建一級(jí)預(yù)測(cè)模型 應(yīng)用USDA Integrated Predictive Modeling Program Tools(IPMP 2014)工具中Full Growth Models中的Huang Model、Baranyi Model、Gompertz Model分別對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的擬合,建立初級(jí)模型,獲得最大比生長(zhǎng)速率。對(duì)不同模型SSE、MSE、RMSE、AIC等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行比較,確定最適初級(jí)預(yù)測(cè)模型。Huang Model的表達(dá)式為:

式(1)

式(2)

式中:t,時(shí)間(h);Y(t),t時(shí)的菌數(shù)(ln CFU/g);Y0,初始菌數(shù)(ln CFU/g);Ymax,最大菌數(shù)(ln CFU/g);μmax,最大比生長(zhǎng)速率(ln CFU/g/h);λ,延滯期時(shí)間(h);α,延滯期變異系數(shù)為4[16]。

1.2.5 應(yīng)用IPMP 2013構(gòu)建二級(jí)預(yù)測(cè)模型 應(yīng)用USDA Integrated Predictive Modeling Program Tools(IPMP 2014)工具中Secondary models-Temperature effect中的Ratkowsky(3)、Huang rate(4)、Cardinal(5)、Arrhenius-type(6)這4個(gè)模型,擬合鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌最大比生長(zhǎng)速率與溫度的函數(shù)關(guān)系,建立二級(jí)模型,并通過誤差平方和SSE,均方誤差MSE,均方根誤差/標(biāo)準(zhǔn)誤差RMSE,殘留標(biāo)準(zhǔn)偏差Residual stdev等模型參數(shù)進(jìn)行擬合度的比較,對(duì)所建立模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。模型表達(dá)式如下:

式(3)

式(4)

μmax=μopt(T-Tmax)(T-Tmin)2/[(Topt-Tmin)(T-Topt)-(Topt-Tmax)(Topt+Tmin-2T)](Topt-Tmin)

式(5)

式(6)

式(3)中:μ,最大比生長(zhǎng)速率(ln CFU/g/h);T,特定生長(zhǎng)溫度(℃);T0,最低生長(zhǎng)溫度;a,模型的參數(shù);

表1 不同模型相關(guān)參數(shù)的比較Table 1 The comparison of different model parameters

式(4)中:μ,最大比生長(zhǎng)速率(ln CFU/g/h);T,特定生長(zhǎng)溫度(℃);Tmin,最低生長(zhǎng)溫度;a,模型的參數(shù);

式(5)中:μmax,最大比生長(zhǎng)速率(ln CFU/g/h);T,特定生長(zhǎng)溫度(℃);Tmin和Tmax,最低生長(zhǎng)溫度和最高生長(zhǎng)溫度;μopt,最適溫度Topt下的生長(zhǎng)速率(ln CFU/g/h);

式(6)中:μmax,最大比生長(zhǎng)速率(ln CFU/g/h);T,特定生長(zhǎng)溫度(℃);R,氣體常數(shù)(8.134 J/mol);ΔG′,與細(xì)菌生長(zhǎng)有關(guān)的一種動(dòng)能;a和n,模型的參數(shù)。

1.2.6 二級(jí)預(yù)測(cè)模型的評(píng)價(jià) 對(duì)二級(jí)模型進(jìn)行數(shù)學(xué)評(píng)價(jià),分析Ratkowsky Model、Huang rate Model、Cardinal Model、Arrhenius-type Model等二級(jí)模型擬合的最大比生長(zhǎng)速率預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值之間的擬合程度,分別用A

式(7)

式(8)

式(7)式(8)中obs是實(shí)驗(yàn)實(shí)際測(cè)得的微生物數(shù)量;pred是應(yīng)用生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型得到的與obs同一時(shí)間的微生物數(shù)量;n是實(shí)驗(yàn)次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1初級(jí)預(yù)測(cè)模型的建立

根據(jù)10、15、20、25、30、35 ℃乙型副傷寒沙門氏菌在鮮切黃瓜中生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)觀察值,選用Huang Model、Baranyi Model、Gompertz Model、Buchanan Three-Phase Linear Model分別描述乙型副傷寒沙門氏菌在鮮切黃瓜中的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和生長(zhǎng)曲線顯示乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)出三個(gè)階段,包括延滯期、指數(shù)期和穩(wěn)定期。通過不同模型SSE、MSE、RMSE、AIC等相關(guān)參數(shù)的比較,確定初級(jí)預(yù)測(cè)模型,如表1所示。

圖1 Huang模型擬合的10、15、20、25、30、35 ℃條件下測(cè)定的鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)Fig.1 The growth data of Salmonella Paratyphi B in cucumber fitted of Baranyi model at different temperatures for 10,15,20,25,30,35 ℃,respectively

SSE、MSE、RMSE、residual stdev、AIC是對(duì)方程的錯(cuò)誤分析,參數(shù)值越小,表明方程描述乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)誤差越小。

表2 Huang模型和Baranyi模型不同溫度下乙型副傷寒沙門氏菌的最大比生長(zhǎng)速率和延滯期Table 2 The maximum growth rate and lag of Salmonella Paratyphi B at different temperatures

SSE代表誤差平方和,MSE代表均方誤差,RMSE代表均方根誤差/標(biāo)準(zhǔn)誤差,residual stdev 代表殘差方差,AIC代表Akaike準(zhǔn)則。通過誤差分析(誤差大小A

圖2 Baranyi模型擬合的10、15、20、25、30、35 ℃條件下測(cè)定的鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)Fig.2 The growth data of Salmonella Paratyphi B in cucumber fitted of Baranyi model at different temperatures for 10,15,20,25,30,35 ℃,respectively

在10 ℃時(shí),乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)比較緩慢,延滯期時(shí)間較長(zhǎng);隨著溫度的升高,乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)逐漸加快,延滯期時(shí)間明顯縮短,最大比生長(zhǎng)速率逐漸增加,具體數(shù)值見表2。因此得出,在本研究設(shè)立的10～35 ℃的范圍內(nèi),乙型副傷寒沙門氏菌的延滯期時(shí)間隨著孵育時(shí)間的增加而降低;相反,乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)速率隨著孵育溫度而增加,由此表明風(fēng)險(xiǎn)隨溫度的升高而增加。

2.2二級(jí)模型的建立

應(yīng)用Ratkowsky、Huang rate、Cardinal、Arrhenius-type這4個(gè)模型,將表2中得到的Huang模型和Baranyi模型的最大比生長(zhǎng)速率與溫度這一環(huán)境條件進(jìn)行擬合,擬合結(jié)果見圖3、圖4、表3。由此可知,在對(duì)最大比生長(zhǎng)速率的擬合方面,Huang模型擬合的Ratkowsky、Huang rate、Cardinal、Arrhenius-type這4個(gè)二級(jí)模型的SSE、MSE、RMSE、Residual stdev(殘留標(biāo)準(zhǔn)偏差)參數(shù)值均小于Baranyi模型擬合結(jié)果,參數(shù)值越小表明方程描述沙門氏菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)誤差越小,方程的擬合度越好,通過參數(shù)值分析4個(gè)二級(jí)模型擬合度為Cardinal Model>Arrhenius-type Model>Ratkowsky Model>Huang rate Model。

表3 不同模型相關(guān)參數(shù)的比較Table 3 The comparison of different model parameters

2.3二級(jí)模型的評(píng)價(jià)

圖3 Huang模型不同溫度條件下乙型副傷寒沙門氏菌的最大比生長(zhǎng)速率擬合的Ratkowsky、Huang rate、Cardinal、Arrhenius-type模型Fig.3 Huang Model under different temperature conditions of Salmonella Paratyphi B in the maximum specific growth rate fitting Ratkowsky,Huang rate,Cardinal,Arrhenius-type model

圖4 Baranyi模型不同溫度條件下乙型副傷寒沙門氏菌的最大比生長(zhǎng)速率擬合的Ratkowsky、Huang rate、Cardinal、Arrhenius-type模型Fig.4 Baranyi Model under different temperature conditions of Salmonella Paratyphi B in the maximum specific growth rate fitting Ratkowsky,Huang rate,Cardinal,Arrhenius-type model

2.3.1 二級(jí)模型的數(shù)學(xué)評(píng)價(jià) 對(duì)由Huang Model擬合的二級(jí)模型進(jìn)行數(shù)學(xué)評(píng)價(jià),一級(jí)模型中Huang Model擬合的最大比生長(zhǎng)速率觀測(cè)值及其與溫度構(gòu)建的Ratkowsky Model、Huang rate Model、Cardinal Model、Arrhenius-type Model等二級(jí)模型擬合的最大比生長(zhǎng)速率預(yù)測(cè)值見表4。預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值之間的擬合程度分別用A

表4 不同溫度條件下沙門氏菌的觀測(cè)值和預(yù)測(cè)值Table 4 Observed and predicted values of Salmonella Paratyphi B under different temperatures conditions

注:在每一行中,數(shù)值后不同的大寫字母表示預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值之間存在的差異絕對(duì)值。

2.3.2 恒定溫度實(shí)測(cè)驗(yàn)證評(píng)價(jià) 應(yīng)用IPMP 2013軟件由Huang Model一級(jí)模型擬合構(gòu)建的Cardinal Model二級(jí)模型,進(jìn)一步進(jìn)行恒定溫度的樣品實(shí)測(cè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用建立的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型求得30 ℃和35 ℃ 貯藏時(shí)的預(yù)測(cè)值,與鮮切黃瓜中30 ℃和 35 ℃貯藏實(shí)驗(yàn)中實(shí)際樣品的沙門氏菌生長(zhǎng)數(shù)值進(jìn)行比較,見表5,采用偏差度(Bias factor,Bf,)和準(zhǔn)確度(Accuracy factor,Af,)來評(píng)價(jià)已經(jīng)建立的沙門氏菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的可靠性。驗(yàn)證指標(biāo)值Bf與Af值均處于1.03～1.12之間,均接近于1,說明該模型對(duì)鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)行為具有良好的預(yù)測(cè)能力。

表5 不同溫度下實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的比較Table 5 The comparison of measured values and predicted values under different temperature

3 結(jié)論

本研究利用USDA Integrated Predictive Modeling Program(IPMP 2013)工具中的一級(jí)和二級(jí)模型,擬合不同溫度(10、15、20、25、30、35 ℃)下乙型副傷寒沙門氏菌在鮮切黃瓜中的生長(zhǎng)變化情況,分別用Huang模型和Baranyi模型進(jìn)行擬合,建立了鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)一級(jí)模型,并在此基礎(chǔ)上,采用Ratkowsky模型、Huang rate模型、Cardinal模型、Arrhenius-type模型描述溫度與比生長(zhǎng)速率的關(guān)系,建立相應(yīng)的二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。結(jié)果表明,Huang模型更適合用于預(yù)測(cè)不同溫度下鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌隨時(shí)間增長(zhǎng)的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和生長(zhǎng)曲線顯示乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)出三個(gè)階段,包括延滯期,指數(shù)期和穩(wěn)定期。在10、15、20、2 5、30、35 ℃條件下,乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)速率分別為0.059、0.274、0.548、0.820、1.100、1.294 ln CFU/g/h,延滯期分別為 19.741、10.944、6.634、4.976、2.171、1.448 h。乙型副傷寒沙門氏菌的延滯期時(shí)間隨著孵育時(shí)間的增加而降低。相反,乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)速率隨著孵育溫度而增加,由此表明風(fēng)險(xiǎn)隨溫度的升高而增加。Cardinal模型可較好描述鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌比生長(zhǎng)速率與溫度的變化關(guān)系,驗(yàn)證指標(biāo)Af 值與Bf值均處于1.03～1.12之間,說明該模型對(duì)鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)行為具有良好的預(yù)測(cè)能力。本研究構(gòu)建的預(yù)測(cè)微生物學(xué)模型可為乙型副傷寒沙門氏菌行為變化的研究以及沙門氏菌定量微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供有效的數(shù)據(jù)基礎(chǔ),為控制鮮切黃瓜及其制品的生產(chǎn)、加工、流通、貯藏條件,以及保障鮮切黃瓜食用安全提供一定的參考依據(jù)。

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