檸檬桉樹皮單寧的提取純化及抗氧化活性

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(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西南寧 530004)

檸檬桉(Eucalyptuscitriodora),良好的速生用材樹種和很好的芳香油樹種[1],是人造板和制漿造紙的優(yōu)良原料[2-3]。其化學(xué)成分研究集中于枝葉,其揮發(fā)油的主要化學(xué)成分是香茅醛、香茅醇、異胡薄荷醇和乙酸香茅酯[4-8]。

單寧(Tannins),多酚的中、高化合物,富有許多獨(dú)特的生理活性,如抗菌、抗氧化和抗過敏作用。在單寧抗菌性方面,黃增[9]等研究發(fā)現(xiàn)巨尾桉葉單寧對金黃色葡萄球菌、酵母菌、沙門氏菌等均有較強(qiáng)的抑制作用;在抗氧化方面,Katsubet[10]、顧海峰[11]、石錦芹[12]、馬希漢[13]等研究發(fā)現(xiàn)柿子單寧具有較強(qiáng)的抗LDL氧化能力、清除自由基能力和抗油脂氧化能力;在抗過敏方面,楊文錕等[14]研究發(fā)現(xiàn)柿子單寧有很強(qiáng)的抗過敏活性。大量研究證明了單寧在醫(yī)療和保健上的實(shí)用價值,而對于檸檬按樹皮的單寧的相關(guān)研究尚未進(jìn)行,本文以檸檬桉樹皮為原料進(jìn)行單寧的提取和抗氧化活性的研究,期望以可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證檸檬桉樹皮的價值。

本實(shí)驗(yàn)采用溶劑浸提法對檸檬桉樹皮單寧進(jìn)行提取,以顏色反應(yīng),沉淀反應(yīng),紫外掃描等對單寧作定性分析,利用單寧酸以福林酚法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線作定量分析,在提取方面,在單因素的條件下采用四因素三水平正交得出其最優(yōu)的提取工藝;在抗氧化研究方面,采用大孔吸附樹脂純化法分離純化檸檬桉樹皮粗提物,考察不同純度單寧的總抗氧化性和清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)和羥基自由基(·OH)的能力,評價其抗氧化性能,為檸檬桉樹皮的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

檸檬桉樹皮 2016年5月采自于廣西機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園;二苯代苦味肼(DPPH·) Sigma公司;DM130、ADS-17、NKA、AB-8、S-8、X-5、D101、HPD826、HPD400、HPD800 南開大學(xué)化工廠;單寧酸標(biāo)品 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;抗壞血酸 分析純,上海試四赫維化工有限公司;無水乙醇,無水碳酸鈉,七水合硫酸亞鐵,水楊酸,30%過氧化氫,磷酸鈉,鉬酸銨 分析純,廣東光華科技股份有限公司。

KQ-600DB型數(shù)控超聲清洗器 云南昆山超聲儀器有限公司,Agilent-8453E型紫外可見分光光度計(jì) 美國安捷倫公司,HL-2恒流泵 上海青浦滬西儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檸檬桉樹皮單寧的提取 參考文獻(xiàn)[15-16],取新鮮的檸檬桉樹皮在恒溫干燥箱中60 ℃烘干,將其粉碎過60目篩,得到干燥的檸檬桉樹皮粉末原料。稱取100.0 g干燥檸檬桉樹皮粉末按1∶4料液比加入石油醚在70 ℃油浴條件下對原料進(jìn)行回流脫脂,干燥密封保存。取5.0 g脫脂后檸檬桉樹皮粉末,料液比1∶20 g·mL-1,加入60%的乙醇水溶液,超聲功率800 W,提取溫度60 ℃條件下提取時間30 min,離心過濾得到粗提液;

另取5.0 g脫脂后檸檬桉樹皮粉末,以料液比1∶20 g·mL-1,加入60%的乙醇水溶液,提取溫度60 ℃條件下用溶劑法提取30 min,比較兩者的單寧得率。

1.2.2 單寧的定性和定量分析

1.2.2.1 粗提液的定性分析 粗提液和單寧酸標(biāo)液分別滴加1%的明膠溶液,觀察溶液中是否有白色絮狀物產(chǎn)生。粗提液和單寧酸標(biāo)液分別滴加0.3% FeCl3溶液,觀察溶液顏色的變化。37%～40%的甲醛1 mL和濃鹽酸2 mL加入粗提液中,沸水浴30 min,觀察是否出現(xiàn)沉淀。

1.2.2.2 粗提液的定量分析

1.2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法,以單寧酸做標(biāo)品,蒸餾水為溶劑,分別配制0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30 mg/mL單寧酸溶液,取1 mL單寧酸溶液到6個25 mL容量瓶,采用福林酚法顯色,紫外可見分光光度計(jì)在500～900 nm范圍掃描最大吸收波長,再在最大吸收波長處測定系列標(biāo)液吸光度。以單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度x(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2.2 樣品中單寧含量的測定 量取一定體積提取液,用福林酚法顯色后,測定其在工作波長處的吸光值,根據(jù)線性方程及公式(1)計(jì)算檸檬桉果實(shí)中單寧的得率。

式(1)

式中:V為容量瓶的體積(25 mL);W為檸檬桉樹皮中單寧得率(%);x為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的提取液中所含單寧的含量(mg·mL-1);V1為提取液的總體積(mL);V2為測定時所取提取液的體積(mL);M為檸檬桉樹皮的質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 提取時間對單寧提取率的影響 準(zhǔn)確稱取7份5 g原料分別置于250 mL錐形瓶中,按料液比為1∶20 g·mL-1分別加體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇水溶液提取液,采用溶劑法提取,設(shè)定提取溫度為60 ℃,提取時間分別為30、60、90、120、150、180、210 min,測定單寧提取率。

1.2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對單寧提取率的影響 準(zhǔn)確稱取11份5 g原料分別置于250 mL錐形瓶中,按料液比為1∶20 g·mL-1分別加入0,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%乙醇水溶液提取液,采用溶劑法提取,提取時間為150 min,提取溫度為60 ℃,測定單寧提取率。

1.2.3.3 提取溫度對單寧提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5份5 g預(yù)處理后的檸檬桉樹皮粉分別置于250 mL錐形瓶中,按料液比為1∶20 g·mL-1分別加體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇水溶液提取液,采用溶劑法提取,提取時間為150 min,提取溫度為40,50,60,70,80 ℃,測定單寧提取率。

1.2.3.4 料液比對單寧提取率的影響 準(zhǔn)確稱取6份5 g原料置于錐形瓶中,按料液比分別1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g·mL-1,分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇水溶液提取液,搖勻靜置。并將其至于50 ℃恒水浴中加熱150 min,測定單寧提取率。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 由于需要考慮的單因素實(shí)驗(yàn)次數(shù)太多,采用正交設(shè)計(jì)可以有效的選擇一些具有代表性的水平組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn),單寧的提取實(shí)驗(yàn)考察了4個單因素,因此采用正交表對檸檬桉樹皮進(jìn)行提取,實(shí)驗(yàn)參數(shù)范圍由單因素條件得出,正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 溶劑法正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平 Table 1 Factors and levels of the orthogonal test for solvents extraction

1.2.5 檸檬桉果實(shí)單寧樣品的分離與純化

1.2.5.1 乙酸乙酯萃取 100 mL粗提液,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出溶劑后40 ℃干燥。干燥后的粗提物用適量50%乙醇溶解后,在緩緩加入無水乙醇,邊加邊攪拌使得最終乙醇水體積比為9∶1,充分?jǐn)嚢韬?在室溫下靜置24 h后,離心(4200 r·min-1,10 min),40 ℃下回收乙醇。用等體積的石油醚萃取3次,收集水相,水相用等體積氯仿萃取3次,收集水相,在用等體積的乙酸乙酯萃取6次,合并6次萃取的乙酸乙酯相,收集乙酸乙酯相和乙酸乙酯萃余相,分別在40 ℃下回收乙酸乙酯,40 ℃恒溫烘干得到檸檬桉果實(shí)單寧的乙酸乙酯萃取相和乙酸乙酯萃余相純化樣品[15]。將乙酸乙酯萃取和萃余相溶解通過大孔樹脂純化后,得到萃取經(jīng)大孔樹脂純化物和萃余經(jīng)大孔樹脂純化物。

1.2.5.2 大孔樹脂的靜態(tài)篩選 稱取已預(yù)處理的X-5、HPD826、HPD800、DM130、D-101、NKA、ADS-17、S-8、HPD400和AB-8型樹脂各2 g,分別裝入250 mL錐形瓶中,然后加入55 mL質(zhì)量濃度為13.67 mg/mL的單寧粗提液,置于搖床中,溫度為30 ℃,振蕩速率為110 r·min-1,振蕩24 h后過濾,然后用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇55 mL洗脫樹脂,分別測定濾液及洗脫液中單寧的含量,計(jì)算樹脂的吸附率和解吸率,選出最佳大孔吸附樹脂。

稱取6份2 g已預(yù)處理的HPD826大孔吸附樹脂,分別裝入250 mL錐形瓶中,然后加入55 mL已知質(zhì)量濃度的單寧粗提液,置于搖床中,溫度為30 ℃,振蕩速率為110 r·min-1,振蕩24 h后過濾,然后改變洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%、90%),測定樹脂的解析率,確定最佳洗脫劑體積分?jǐn)?shù)。

式(2)

式(3)

1.2.5.3 HPD826脂對檸檬桉果實(shí)單寧的分離工藝考察 稱取10 g已預(yù)處理的 HPD826大孔吸附樹脂,濕法裝柱。每次量取100 mL樣品溶液上柱,收集流出液。參考其他文獻(xiàn)并且結(jié)合檸檬桉樹皮粗提液的含量,上樣濃度為1.332 mg/mL,通過改變上樣液流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min),通過吸附率的選擇,確定最佳上樣流速;上樣流速為1.0 mL/min,改變上樣液質(zhì)量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL),通過吸附率和吸附量的選擇,確定最佳上樣質(zhì)量濃度;以1.332 mg/mL上樣質(zhì)量濃度和1.0 mL/min上樣濃度上樣,吸附完成后,通過改變洗脫流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min),通過解吸率選擇,確定最適洗脫流速。

1.2.3.4 各純化樣品的純度測定 通過不同的純化方法得到不同的純化樣品,采用福林酚法測定其中單寧的含量,取一定體積的各純化物樣品于事先稱重的培養(yǎng)皿中,烘干至恒重,計(jì)算單寧占純化樣品總質(zhì)量的比例,即為單寧的純度。

式(4)

式中：m1為一定體積純化樣品中單寧的含量(mg);式中m2為一定體積純化樣品的總質(zhì)量(mg)。

1.2.6 檸檬桉樹皮單寧的抗氧化性的測定

1.2.6.1 總抗氧化性的測定 依次取10 mL的刻度試管分別編號,各加入不同濃度的樣品溶液2.0 mL,再分別加入0.6 mol/L濃硫酸、28 mmol/L鉬酸銨、4 mmol/L磷酸鈉各2.0 mL,混勻后于95 ℃溫度下,水浴90 min,在695 nm處測定其吸光度,每個濃度平行測定3次,取平均值。以單寧酸作為對照,以蒸餾水作參比液,吸光度越大,總抗氧化能力越強(qiáng)[17-18]。

1.2.6.2 DPPH·的清除作用 配制濃度為4×10-3mol/L DPPH·無水乙醇溶液。取樣品溶液2 mL和2 mL DPPH·溶液搖勻后,放置30 min,以蒸餾水和乙醇1∶1比例做空白,在517 nm處測定吸光度記為A1,2 mL蒸餾水加DPPH·溶液,搖勻,在517 nm測定吸光度A0,2 mL樣品溶液加2 mL蒸餾水,搖勻,在517 nm測定吸光度A2。每個濃度平行測定3次,取平均值。以單寧酸作為對照[19-22],依照上述方法測定,根據(jù)公式(5)分別計(jì)算樣液和單寧酸對DPPH·的清除率:

式(5)

式中,A2為樣品自身對吸光度的貢獻(xiàn);A0為DPPH·本身吸收數(shù)值;A1為樣品對DPPH·作用后的吸光度數(shù)值。清除率越大,說明樣品對DPPH·的清除效果越好。

1.2.6.3 ·OH的清除作用 根據(jù)文獻(xiàn)[16]中的方法,用蒸餾水分別配制9 mmol/L的FeSO4溶液和9 mmol/L的過氧化氫溶液;用無水乙醇配制9 mmol/L的水楊酸溶液[15-16,20]。測定各樣液對·OH的清除作用。清除率越大,說明樣品對·OH的清除效果越好。清除自由基活力SA(Scavenging Activity)可用公式(6)表示:

式(6)

式中,Aj為僅加入待測液的吸光度;Ac為不加待測液時的吸光度;Ai為加入待測液和FeSO4溶液、過氧化氫溶液、水楊酸溶液的吸光度。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按照對應(yīng)公式進(jìn)行計(jì)算,平行測定三次,并作圖,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示

2 結(jié)果與分析

2.1單寧的定性與定量分析

2.1.1 單寧的定性分析 滴加1%明膠溶液后,檸檬桉樹皮粗提液和單寧酸中均產(chǎn)生白色絮狀物;滴加0.3%三氯化鐵溶液后,粗提液和單寧酸均變?yōu)槟G色,兩者均為單寧的特征反應(yīng)現(xiàn)象,證明檸檬桉樹皮粗提物中含有單寧類化合物滴加甲醛溶液和濃鹽酸溶液后,沸水浴后,溶液產(chǎn)生磚紅色沉淀,證明檸檬桉提物中所含單寧為縮合單寧。

2.1.2 單寧的定量分析 經(jīng)福林酚法顯色后,單寧酸標(biāo)品在758 nm處有最大吸收,以吸光值y和單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積x得到回歸方程:y=93.781x+0.0584(線性范圍0.002～0.012 mg/mL,R2=0.9995),y為吸光度,x(mg/mL)為單寧質(zhì)量濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curvr of Tannins

2.2檸檬桉樹皮單寧的提取-單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 提取方法對檸檬桉樹皮單寧得率的影響 本文主要采用溶劑法提取,以水和乙醇按比例混合作為溶劑。同時本文考察了超聲波輔助法對檸檬桉樹皮中單寧的提取。兩種方法單寧的得率分別為9.39%和10.26%。提取結(jié)果說明在相同的提取條件下,超聲波輔助法相比于溶劑法提取,單寧得率提高了0.87%,但超聲波輔助法提存在振蕩過程中噪聲較大的缺點(diǎn),而且從經(jīng)濟(jì)方面考慮,能量消耗較大,成本相對較高。而采用溶劑法在保證單寧得率的同時,對提取設(shè)備要求不高,操作簡單,能耗小、成本低。綜合考慮,本文采用溶劑法提取。

2.2.2 提取時間對檸檬桉樹皮單寧得率的影響 提取時間對檸檬桉樹皮單寧得率的影響結(jié)果如圖2所示。隨著溶劑提取時間的延長,單寧得率增加,在150 min附近單寧得率最大,此后時間延長,單寧得率逐漸降低。這可能是由于到150 min時,單寧已經(jīng)充分溶出,超過150 min時,雜質(zhì)成分溶出較多,單寧類物質(zhì)的氧化分解量也增多,從而導(dǎo)致單寧得率在后半段下降。綜合考慮,溶劑法提取檸檬桉單寧提取時間選擇150 min。

由相關(guān)分析可知,提取時間與單寧得率的相關(guān)系數(shù)為0.66344(p=0.004829<0.01),達(dá)到極顯著水平,說明提取時間對單寧得率有極顯著性影響。

圖2 提取時間對單寧得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on yield of tannin

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對檸檬桉樹皮單寧得率的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對檸檬桉樹皮單寧得率的影響結(jié)果如圖3所示。溶劑法提取檸檬桉樹皮單寧的得率先隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大,在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%時達(dá)到最大,隨后開始顯著降低。這可能是由于乙醇是有機(jī)溶劑,根據(jù)相似相溶理論[23],隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,其他雜質(zhì)成分溶出增多,或者是40%的乙醇體積分?jǐn)?shù)的溶劑極性最適宜單寧的大量溶出,導(dǎo)致40%后單寧得率降低。綜合考慮,溶劑法提取檸檬桉樹皮單寧乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇40%。

由相關(guān)分析可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)與單寧得率的相關(guān)系數(shù)為-0.4815(p=0.000196<0.01),達(dá)到極顯著水平,說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對單寧得率有極顯著性影響。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對單寧得率得影響Fig.3 Effect of the ethanol concertration on yield of tannin

2.2.4 提取溫度對檸檬桉樹皮單寧得率的影響 提取溫度對檸檬桉樹皮單寧得率的影響結(jié)果如圖4所示。在溫度達(dá)到50 ℃之前,提高溶劑提取溫度有利于檸檬桉樹皮單寧的提取,50 ℃后提取溫度過高反而導(dǎo)致單寧得率下降,這可能是由于溫度升高,溶劑揮發(fā),不利于單寧的溶出,而且為其他雜質(zhì)成分的溶出提供了有利條件,綜合考慮,溶劑法提取檸檬桉樹皮單寧提取溫度選擇50 ℃。

由相關(guān)分析可知,提取溫度與單寧得率的相關(guān)系數(shù)為-0.30617(p=0.002342<0.01),達(dá)到極顯著水平,說明提取溫度對單寧得率有極顯著性影響。

圖4 提取溫度對單寧得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on yield of tannin

2.2.5 料液比對檸檬桉樹皮單寧得率的影響 料液比對檸檬桉樹皮單寧得率的影響結(jié)果如圖5。檸檬桉樹皮單寧得率先隨溶劑料液比的減小呈上升趨勢,料液比達(dá)到1∶50 g·mL-1時,單寧得率達(dá)到最大值,隨后料液比再減小,單寧得率呈下降趨勢。這是由于大的料液比不利于單寧的溶出,小的料液比稀釋了提取液的質(zhì)量濃度,導(dǎo)致單寧得率降低。而且溶劑量過大后續(xù)會增加提取液濃縮、分離純化等工作的壓力和時間。綜合考慮,溶劑法提取檸檬桉樹皮單寧的最佳料液比選擇1∶50 g·mL-1。

由相關(guān)分析可知,料液比與單寧得率的相關(guān)系數(shù)為0.88122(p=0.00064<0.01),達(dá)到極顯著水平,說明料液比對單寧得率有極顯著性影響。

圖5 料液比對單寧得率的影響Fig.5 Effect of feed liquid ratio on yield of tannin

2.3溶劑法提取檸檬桉樹皮單寧的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

溶劑法提取檸檬桉樹皮單寧的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 溶劑法正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 2 Orthogonal experimental design and result analysis of solvents extraction

從表中極差分析可以看出,各因素對單寧得率的影響主要順序是C>D>A>B,即乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>提取溫度>提取時間。溶劑法提取最佳組合條件為A3B2C2D2即提取溫度60 ℃,提取時間150 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶50 g·mL-1。該組合不在正交表中。為此對最佳組合進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照溶劑法的優(yōu)化條件,進(jìn)行3次提取平行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表3所示。經(jīng)計(jì)算:溶劑法提取檸檬桉樹皮單寧得率分別為:13.19%、13.53%、14.30%,平均得率為13.67%,比正交實(shí)驗(yàn)最高得率13.07%,提高幅度4.59%,SD=0.46,RSD%=4.16%(n=3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,優(yōu)化后的工藝提取條件單寧得率高,穩(wěn)定性好,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表3 溶劑法優(yōu)化條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Test result of optimal conditions of solvents extraction

2.5純化方法對單寧純度的影響

實(shí)驗(yàn)選擇吸附樹脂類型,結(jié)果如表4所示,實(shí)驗(yàn)條件下,HPD826型樹脂對檸檬桉樹皮單寧的吸附率和解析率均高于其他樹脂,達(dá)到90.10%、92.05%,選擇HPD826型樹脂進(jìn)行動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn);上樣流速對HPD826型大孔樹脂吸附單寧的影響由圖6可看出,上樣流速越大,吸附率反而越低,雖然在0.5 mL/min 的流速下,吸附效果最好,但工作效率低,綜合考慮選擇1.0 mL/min的流速上樣。

圖6 不同上樣流速對檸檬桉果實(shí)單寧的吸附效果的影響Fig.6 The effect of feed elution rate on adsorption effect of tannin

上樣質(zhì)量濃度對HPD826型大孔樹脂吸附單寧的影響如圖7所示,隨著樣液濃度的上升,吸附率先上升,在樣液濃度為1.33 mg/mL時最大,吸附率達(dá)到98.52%,隨后下降,所以選擇1.33 mg/mL為單寧的上樣質(zhì)量濃度;洗脫流速對HPD826型大孔樹脂吸附單寧的影響由圖8可看出,洗脫流速越大,解析率反而越低,雖然在0.5 mL/min的流速下,解析效果最好,但工作效率低,綜合考慮選擇1.0 mL/min的流速解析;乙醇的體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響,結(jié)果見圖9,體積分?jǐn)?shù)低的乙醇溶液只能洗脫少部分的單寧,解析率隨著乙醇濃度的上升,在50%時達(dá)到最大,隨后下降,故選擇50%的乙醇為最適宜洗脫劑濃度。

表4 10種大孔樹脂對樣品中單寧的靜態(tài)吸附和解吸結(jié)果Table 4 Results of adsorption and desorption for tannin ten types resin

表5 樣品純度分析結(jié)果Table 5 Purity of the crude extract and purified samples

圖7 樣液濃度對檸檬桉果實(shí)單寧吸附效果的影響Fig.7 The effect of feed concentration on adsorption effect of tannin

圖8 不同洗脫流速對檸檬桉果實(shí)單寧解吸的影響Fig.8 The effect of elution rate on desorption efficiency

圖9 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對檸檬桉果實(shí)單寧靜態(tài)解吸的影響Fig.9 The effect of ethanol concentration on static desorption efficiency

因此,大孔吸附樹脂純化的最佳工藝參數(shù)為:以HPD826樹脂為吸附樹脂,上樣流速1.0 mL/min,上樣濃度1.33 mg/mL,洗脫流速1.0 mL/min,乙醇洗脫劑體積分?jǐn)?shù)50%。

在最優(yōu)的分離純化工藝條件下,采用不同的純化方法純化樣液,結(jié)果如表5所示。由圖可知,不同純化方法得到的樣品純度各不相同。粗提物經(jīng)乙酸乙酯萃取后純度約為粗提物的3.0倍,經(jīng)大孔樹脂純化后純度約為粗提物的3.5倍,萃取和大孔樹脂純化聯(lián)用得到的乙酸乙酯萃取經(jīng)大孔樹脂純化的樣品純度約為粗提物的5.5倍,乙酸乙酯萃余經(jīng)大孔樹脂純化的樣品純度約為粗提物的5.3倍。結(jié)果說明采用溶劑萃取與大孔樹脂聯(lián)用方法能有效提高檸檬桉樹皮單寧提取物的純度,效果較好。

2.6檸檬桉樹皮單寧的抗氧化性研究

2.6.1 單寧的總抗氧化性 以單寧酸作為對照品,考察不同純度的單寧質(zhì)量濃度在0.01～0.10 mg/mL時的總抗氧化性,結(jié)果如圖所示。以吸光度的大小可以直接得出樣品和磷鉬試劑反應(yīng)的強(qiáng)弱,從而得到樣品的總抗氧化性大小。由圖10可知濃度范圍內(nèi),總抗氧化性隨著樣液濃度增加而呈現(xiàn)上升趨勢,總抗氧化性呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。樣品基本在樣液濃度為0.1 mg/mL時有最好的總抗氧化性。此時,各物質(zhì)的總抗氧化性大小為:乙酸乙酯萃取物>乙酸乙酯萃取過大孔樹脂純化物>大孔樹脂純化物>粗提物>單寧酸>乙酸乙酯萃余過大孔樹脂純化物>抗壞血酸。

圖10 不同質(zhì)量濃度試樣的總抗氧化性Fig.10 The total oxidation resistance of different concentration samples

表6 不同純度單寧的抗氧化活性 Table 6 Antioxidant capacity from different purification tannin

樣液濃度為0.1 mg/mL時的總抗氧壞性均強(qiáng)于抗壞血酸,此時乙酸乙酯萃取物、乙酸乙酯萃取過大孔樹脂純化物、大孔樹脂純化物、粗提物、乙酸乙酯萃余過大孔樹脂純化物的總抗氧化性分別是是抗壞血酸的142.38%、134.38%、127.38%、126.53%、116.05%,乙酸乙酯萃取物的總抗氧化性是單寧酸的116.88%,乙酸乙酯萃取過大孔樹脂純化物的總抗氧化性是單寧酸的110.32%,大孔樹脂純化物、粗提物和乙酸乙酯萃余過大孔樹脂純化物的總抗氧化性與單寧酸基本相等,其總抗氧化性分別為單寧酸的104.57%、103.79%、95.27%?？傮w來說,檸檬桉樹皮不同純度的單寧樣品的總抗氧化性比較好。

2.6.2 單寧對DPPH·的清除效果 結(jié)果如圖11所示。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),樣品對DPPH·的清除率隨著濃度的增加而上升,清除率呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性,在10 μg/mL時達(dá)到最大,最大清除率見表6,單寧酸的清除率高于各樣品。

圖11 不同質(zhì)量濃度試樣對DPPH·的清除曲線Fig.11 Scavenging rates of different samples:DPPH·free radical

根據(jù)表6的IC50值,各樣品對DPPH·自由基的清除率依次為單寧酸>抗壞血酸>乙酸乙酯萃余過大孔樹脂純化物>大孔樹脂純化物>粗提物>乙酸乙酯萃取物>乙酸乙酯萃取過大孔樹脂純化物,根據(jù)圖7的結(jié)果,對DPPH·自由基的清除率依次為單寧酸>抗壞血酸>大孔樹脂純化物>乙酸乙酯萃余過大孔樹脂純化物>乙酸乙酯萃取物>粗提物>乙酸乙酯萃取過大孔樹脂純化物,二者結(jié)果并不一致,說明隨著濃度的增加,其對各樣品清除DPPH·自由基能力的影響程度的差異也越來越明顯。其中,大孔樹脂純化物對DPPH·自由基的最大清除率為79.63%,達(dá)到單寧酸的86.43%,抗壞血酸的92.66%,乙酸乙酯萃余經(jīng)大孔樹脂純化物、乙酸乙酯萃取物、粗提物的清除率分別為單寧酸的75.30%、70.67%、67.87%,為抗壞血酸的80.97%、75.76%、72.76%。說明各樣品對DPPH·自由基具有一定的清除效果但不明顯。

2.6.3 單寧對·OH的清除效果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12。由圖可知,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),各樣液對·OH自由基的清除率隨著濃度的增大而增大,清除率呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。在樣品濃度1.0 mg/mL時,清除率達(dá)到最大。各樣液對·OH自由基的最大清除率排列順序?yàn)?抗壞血酸>粗提物>單寧酸>大孔樹脂純化物>乙酸乙酯萃取過大孔樹脂純化物>乙酸乙酯萃取物>乙酸乙酯萃余過大孔樹脂純化物。大孔樹脂純化物、乙酸乙酯萃取過大孔樹脂純化物與單寧酸對·OH自由基的最大清除率幾乎相等,都達(dá)到77%以上,粗提物對·OH自由基的最大清除率為83.08%,其清除效果是單寧酸的104.18%,是抗壞血酸的88.48%。粗提物的單寧純度較低但對·OH自由基的清除率高,乙酸乙酯萃余過大孔樹脂純化物的單寧純度較高而清除率相對較低,說明雜質(zhì)中可能存在具有·OH自由基清除能力的物質(zhì)。

圖12 不同質(zhì)量濃度試樣對·OH的清除曲線Fig.12 Scavenging tares of different samples:·OH free radical

綜上可知,不同純度的單寧對DPPH·和·OH自由基的清除能力的差異較大,原因可能是兩者的反應(yīng)機(jī)理和條件不同,也不排除雜質(zhì)中含有清除DPPH·和·OH自由基能力的物質(zhì)的可能。不同純度的單寧對DPPH·的清除能力與單寧酸、抗壞血酸相比相對較弱,對·OH自由基的清除效果較好。單寧對·OH自由基的清除效果說明,樣液單寧純度與其清除能力不呈正相關(guān)性,說明雜質(zhì)中可能存在大量的具有清除OH·自由基能力的物質(zhì)。

3 結(jié)論

3.1采用顏色反應(yīng)、沉淀反應(yīng)對檸檬桉樹皮單寧進(jìn)行了定性分析,結(jié)果表明,檸檬桉樹皮粉提取物中含有單寧類化合物,單寧種類為縮合單寧。

3.2進(jìn)行了溶劑法提取檸檬桉樹皮單寧工藝研究,可得出提取溫度、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比等因素均對單寧得率有極顯著性影響。優(yōu)化條件最佳提取工藝為是:提取溫度60 ℃,提取時間150 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶50 g·mL-1,單寧得率是13.67%。

3.3采用溶劑萃取法、大孔吸附法、溶劑萃取和大孔吸附聯(lián)用法對檸檬桉樹皮單寧粗提取進(jìn)行分離純化。分離純化所得各樣品中單寧得率分別為13.67%、39.91%、47.97%、72.43%、76.90%。

3.4考察單寧的純化方法和抗氧化活性,結(jié)果表明,不同純化方法得到的檸檬桉樹皮單寧的純度差異較大。各單寧樣品的總抗氧化性、對DPPH·和·OH自由基的清除能力均隨樣品濃度的增大而增大。乙酸乙酯萃取物和乙酸乙酯萃取過大孔樹脂純化物的總抗氧化性分別是抗壞血酸的142.38%、134.38%,是單寧酸的116.88%、110.32%,各種純化物對DPPH·自由基具有一定的清除能力,粗提物對·OH自由基的最大清除率為單寧酸的104.18%?？傮w上看,檸檬桉樹皮不同純度的單寧的抗氧化活性較好。乙酸乙酯萃取物、乙酸乙酯萃取過大孔樹脂純化物、大孔樹脂純化物和粗提物的抗氧化能力較強(qiáng),乙酸乙酯萃余過大孔樹脂純化物的抗氧化能力較弱。

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