金電極循環(huán)伏安法檢測生乳尿素?fù)诫s

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(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047;2.江西陽光乳業(yè)股份有限公司,江西南昌 330043)

生乳是乳制品產(chǎn)業(yè)鏈的源頭,其質(zhì)量安全直接影響后續(xù)乳制品的加工。乳制品中氮含量來源于乳蛋白和非蛋白氮[1],其中正常牛奶中的尿素含量約200～300 mg/L[2],尿素約占乳中非蛋白氮的50%。尿素是蛋白質(zhì)代謝分解的主要含氮終產(chǎn)物,當(dāng)其含量超過人體再利用的范疇后,將會(huì)對人體造成危害[3]。近年來,一些不法商家為了提高利潤空間,在乳中加入尿素造成蛋白質(zhì)增多的假象,如2012年印度牛奶出現(xiàn)摻高濃度尿素的牛奶。高濃度尿素會(huì)造成泌尿系統(tǒng)排泄障礙,導(dǎo)致身體電解質(zhì)失衡[4]。因此,有必要排除生乳的摻雜問題,尿素的檢測監(jiān)督不可或缺。

目前檢測摻入乳中尿素的方法很多,歸納起來主要有以下幾種[5]:直接比色法,通常為基于尿素和試劑所生絡(luò)合物結(jié)構(gòu)及數(shù)量的比色測定[6-8];間接比色法,即通過酶解法來測試,包括尿素酶比色法[9]和酶電極[10]等方法;而實(shí)驗(yàn)室檢測尿素常見的方法有紅外光譜,高效液相色譜和質(zhì)譜法。Santos等人[11-12]使用中紅外光譜法對牛奶中的尿素?fù)诫s物進(jìn)行定性和定量分析;Liu[13]等人采用傅里葉紅外光譜技術(shù)可有效檢測奶中的尿素;宋薇[14]等人運(yùn)用高效液相色譜-熒光檢測器法測定乳及乳粉中尿素;MacMahon[15]和Abernethy[16]等人采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測了奶制品中摻的非蛋白氮,可快速定量定性測量摻雜物。雖然比色法價(jià)格便宜,但操作繁瑣,所需時(shí)間較長,精密度和準(zhǔn)確度有限;紅外光譜法、高效液相色譜及質(zhì)譜法檢測精密度、準(zhǔn)確度高,但都存在耗時(shí)、費(fèi)力、昂貴等問題。

電化學(xué)方法檢測是通過電極獲得有差異的信號,經(jīng)處理所采集的數(shù)據(jù),可對待測樣品的電極界面信息進(jìn)行分析[17]。目前在國外的研究中則以自制脲酶生物傳感器檢測牛奶中的尿素居多[18-20],在國內(nèi)黃贛輝[21]等人運(yùn)用綜合型傳感器陣列檢測生乳摻雜具有良好的甄別效果,而運(yùn)用非修飾電極檢測牛奶中的尿素鮮有報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)以金電極為工作電極,以尿素為生乳摻雜物,采用循環(huán)伏安法對生乳摻雜尿素進(jìn)行檢測,分析電極界面信息,以期得出尿素及其摻入生乳后在電極表面的響應(yīng)特征。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

生乳 江西陽光乳業(yè)股份有限公司長山現(xiàn)代有機(jī)牧場提供;H2SO4(AR) 西隴化工股份有限公司;無水乙醇(AR) 上海振興化工一廠;三氯乙酸(AR)、氫氧化鉀(AR) 天津市大茂化學(xué)試劑廠;尿素(AR) 天津市永大化學(xué)試劑有限公司;γ-Al2O3粉末 上海仙仁儀器儀表有限公司。

CHI440C電化學(xué)石英晶體微天平 上海辰華有限公司;PHS-3C pH計(jì) 上海雷磁有限公司;KQ-2200DP超聲波清洗器 昆山市超聲清洗儀器有限公司;HH-6電熱恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學(xué)儀器廠;TCL-15B高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;金電極、鉑片電極 上海仙仁儀器儀表有限公司;Ag/AgCl參比電極 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 電極預(yù)處理 金電極處理參照石磊[22]等人的方法打磨清洗后,將清洗干凈的電極置于0.5 mol/L H2SO4中活化至CV曲線重合為止(約70周),后于0.01 mol/L[Fe(CN)6]3-/4-中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,若峰電位差在80 mV以下則認(rèn)為電極符合實(shí)驗(yàn)要求,再用超純水清洗,氮?dú)獯蹈杀Ｗo(hù)待用。

1.2.2 樣品數(shù)據(jù)采集方法 在室溫條件下,以金電極為工作電極,鉑片電極為輔助電極,Ag/AgCl電極為參比電極組裝成測定回路,設(shè)置采集參數(shù)后置于待測液中,并進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描30～60圈后收集相對穩(wěn)定的響應(yīng)信號。本次實(shí)驗(yàn)的電位范圍為0～1.4 V,靜置時(shí)間為3 min,掃描速率根據(jù)實(shí)驗(yàn)測試組目的不同而設(shè)置。電化學(xué)測定和其他電學(xué)測定一樣,多用高靈敏度測定電流和電壓的微小變化,而在測定快速的變化時(shí),往往有電噪音的影響,因此所有實(shí)驗(yàn)測試組均在屏蔽箱中進(jìn)行。

1.2.3 尿素溶液的制備 用氫氧化鉀分別制備pH為7.00,7.70,7.76,7.78,7.80,7.82的0.1 mol/L的尿素溶液;制備pH為7.0的1.0 mol/L的尿素溶液。

1.2.4 尿素電化學(xué)特性的研究 在1.2.2節(jié)的條件下,對1.2.3節(jié)中的所有樣品逐一進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描,研究尿素特有的電化學(xué)響應(yīng)信號。

1.2.4.1 尿素電化學(xué)性質(zhì)的研究 以1、2、3、4、5 mV/s的掃描速率分別對pH為7.0、濃度為0.1和1.0 mol/L的尿素溶液進(jìn)行循環(huán)伏安法研究尿素的電化學(xué)響應(yīng)特征。

1.2.4.2 掃描速率對尿素電化學(xué)性質(zhì)的影響 以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、25.0 mV/s的掃描范圍對pH為7.0、濃度為0.1 mol/L的尿素溶液進(jìn)行掃描,研究不同掃描速率對其電化學(xué)性質(zhì)的影響。

1.2.4.3 pH對尿素電化學(xué)性質(zhì)的影響 以5 mV/s的掃描速率來對pH分別為7.70、7.76、7.78、7.80、7.82,濃度為0.1 mol/L的尿素溶液進(jìn)行掃描研究。

1.2.4.4 不同濃度對尿素電化學(xué)性質(zhì)的影響 以1、2、3、4、5 mV/s的掃描速率分別對pH為7.0、濃度為0.1和1.0 mol/L的尿素溶液進(jìn)行掃描研究尿素電化學(xué)反應(yīng)過程的影響。

1.2.5 摻尿素乳樣品的制備 將從奶站取回冷藏保存的生乳放置至室溫,然后摻雜不同濃度尿素的生乳樣品混合液,分別為0.3、0.6、0.9、1.5、2.5 mol/L,再制備摻雜奶樣品中尿素的檢測樣本。含尿素的生乳樣品檢測樣本制備方法為三個(gè)步驟:第一步,從含尿素的生乳中取出4 mL放入45 mL離心管中,用超純水稀釋至13 mL,并加入10%的三氯乙酸溶液2 mL,同時(shí)用振蕩器混勻1 min,促使蛋白質(zhì)凝固;第二步,超聲15 min溶液樣品后,在10000 r/min條件下離心10 min去除脂肪和蛋白質(zhì),獲取清澈液;第三步,將清澈液轉(zhuǎn)移至另一離心管,并用氫氧化鉀溶液調(diào)pH至8.0,進(jìn)一步除去蛋白質(zhì),再次離心10 min,最后所得溶液可用于電化學(xué)檢測。

1.2.6 摻雜乳中尿素的測定 對1.2.5節(jié)中的所有樣品逐一進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,掃描速率5 mV/s,其它條件與1.2.2節(jié)相同,據(jù)此研究摻雜乳中尿素的電化學(xué)特性,同時(shí)研究摻雜了不同濃度的尿素后對其電化學(xué)特性的影響。

1.2.7 檢出限和重現(xiàn)性的測定 將1.2.6測出的含不同濃度尿素?fù)诫s乳樣本的還原峰電流值進(jìn)行線性回歸分析,根據(jù)3N/S計(jì)算檢出限。用同一根金電極作為工作電極,在含尿素濃度為0.9 mol/L的3個(gè)生乳樣品提取液樣本進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,其中,每個(gè)樣本測定3次,據(jù)此研究該法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 由于待測液在金電極進(jìn)行循環(huán)伏安法下的響應(yīng)信號電流數(shù)值都相對較小,因此需要對響應(yīng)電流進(jìn)行放大后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。從CHI440C中導(dǎo)出原始數(shù)據(jù),用MS Office中的Excel組件對數(shù)據(jù)進(jìn)行篩分及放大處理,后導(dǎo)入origin 8.0專業(yè)作圖軟件重新繪制并作相應(yīng)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1尿素的電化學(xué)特性

2.1.1 尿素電化學(xué)性質(zhì)的研究 分別對濃度為0.1和1.0 mol/L尿素溶液進(jìn)行循環(huán)伏安法研究。實(shí)驗(yàn)表明:較低的掃描速率下,尿素溶液在金電極上可產(chǎn)生良好的伏安還原峰(見圖1),峰電位為0.210～0.328 V(vs. Ag/AgCl)。

圖1 0.1 mol/L和1.0 mol/L尿素在金電極上不同掃速的還原峰圖Fig.1 The reduction peak of 0.1 mol/L and 1.0 mol/L urea on gold electrode at various scanning注：a～e分別為于0.1 mol/L尿素溶液中1、2、3、4、5 mV/s 的掃描速率；f～j分別為于1.0 mol/L尿素溶液中1、2、3、4、5 mV/s的掃描速率。

2.1.2 掃描速率對尿素電化學(xué)性質(zhì)的影響 通過以不同速率對0.1 mol/L尿素溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,結(jié)果顯示:尿素的響應(yīng)特征為單峰,無回掃峰,即尿素得電子,由此產(chǎn)生還原反應(yīng)。由于峰電位隨掃速增大而負(fù)移,峰電流值與ν1/2呈線性關(guān)系(見圖2),線性方程為:Ipc=5.7410ν1/2-0.07706,r=0.99784;Ipc=18.9488ν1/2-1.1299,r=0.99086,因此可認(rèn)為低濃度的尿素溶液在電極上的反應(yīng)由擴(kuò)散控制,且為不可逆過程。這個(gè)不可逆過程可能是尿素還原后在電極表面上的擴(kuò)散速度遠(yuǎn)大于化學(xué)反應(yīng)速度所導(dǎo)致,故推斷還原態(tài)的尿素不能停留在電極表面。

圖2 0.1 mol/L尿素在不同掃描速率條件下的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic Voltammograms curve of 0.1 mol/L urea at various scanning rates注：a～e的掃描速率分別為1、2、3、4、5 mV/s;f～g的掃描速率分別為7.5、10、15、20、25 mV/s;角圖為峰電流與掃描速率的關(guān)系曲線圖。

根據(jù)Laviron理論[23],對不可逆反應(yīng)的峰電位與掃描速度關(guān)系應(yīng)遵循關(guān)系式:

Ep=E0+(RT/αnF)[ln(RTKS/αnF)-lnν]

式(1)

式中:E0是標(biāo)準(zhǔn)電勢,R是標(biāo)準(zhǔn)氣體常數(shù)(8.314 J·K-1·mol-1),T是Kelvin溫度,α表示電子轉(zhuǎn)移系數(shù),n為電子轉(zhuǎn)移數(shù),ks(s-1)代表電化學(xué)速率常數(shù),F是法拉第常數(shù)(96487 C/mol)。

根據(jù)式(1),只需要做Ep與lnν的線性關(guān)系(見圖3)即可求αn和ks。由線性方程(Ep=0.33142-0.0652Ln(ν),r=0.99345)的斜率計(jì)算得到αn=0.456,截距可計(jì)算ks=0.43207±0.0001 s-1。

圖3 Ep-Ln(ν)的線性關(guān)系Fig.3 The linear relationships between the potential and scanning rates in logarithmic

2.1.3 pH對尿素電化學(xué)性質(zhì)的影響 在pH為2.4～8.0的體系中進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pH為7.70、7.76、7.78、7.80、7.82的酸度范圍內(nèi),尿素還原峰的峰形較好,峰電流較大。還原峰電位隨溶液pH的增加而負(fù)移,說明還原反應(yīng)有質(zhì)子參與。假若電極反應(yīng)為Oχ+ne+mH+→Red,根據(jù)能特斯方程[24-25],對不可逆反應(yīng)有:

式(2)

以峰電位對pH作圖擬得一條直線,其斜率表明有等數(shù)量的電子和質(zhì)子參與反應(yīng),根據(jù)尿素的線性回歸方程為E=1.02079-0.10566pH,r=0.9926,可計(jì)算出參與還原反應(yīng)的電子數(shù)和質(zhì)子數(shù)均為0.8164,約為1;通過上述的αn=0.456可知,α=0.558。

2.1.4 不同濃度對尿素電化學(xué)性質(zhì)的影響 在pH=7.0的尿素溶液中,實(shí)驗(yàn)了不同濃度的尿素溶液對掃描速率、峰電流的影響,結(jié)果表明:當(dāng)濃度為0.1 mol/L時(shí),Ipc與ν1/2呈線性關(guān)系,表明在此時(shí)電極過程受擴(kuò)散控制;當(dāng)濃度為1.0 mol/L時(shí),還原峰電位仍然隨掃速增大而負(fù)移,峰電流也隨之增大,但I(xiàn)pc既不與ν呈線性關(guān)系,也不與ν1/2呈線性關(guān)系,這是擴(kuò)散及吸附都存在的過程。

表1 牛奶中檢測尿素的幾種方法比較Table 1 Comparison of several methods for detection of urea in milk

2.1.5 尿素在金電極上的反應(yīng)過程 由以上實(shí)驗(yàn)可知,尿素在金電極上的反應(yīng)電子數(shù)和質(zhì)子數(shù)均為1,因此本實(shí)驗(yàn)初步推測尿素在金電極上的反應(yīng)過程為:尿素經(jīng)傳質(zhì)過程到達(dá)金電極表面后,C=O雙鍵由于接收了電極給出的電子而成為C-O鍵,因此碳酰胺發(fā)生還原反應(yīng)且反應(yīng)為不可逆過程,可推斷還原態(tài)的物質(zhì)不能停留在電極表面。

2.2生乳樣品中尿素的測定

2.2.1 樣品中尿素的測定 根據(jù)尿素的電化學(xué)屬性,金電極在含尿素的溶液中進(jìn)行CV掃描,可得到尿素的特征曲線。由于純尿素溶液只發(fā)生還原反應(yīng),因此選擇還原峰的變化趨勢作為實(shí)驗(yàn)的判別依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)將二次離心后取得的含尿素溶液進(jìn)行CV 掃描結(jié)果與相同條件處理的生乳還原峰曲線比較如圖4。

圖4 從生乳中提取含不同尿素濃度清澈液與生乳的循環(huán)伏安曲線Fig.4 Cyclic Voltammograms curve of the clear liquid extracted from raw milk containing urea at different concentrations and raw milk a～e的尿素含量分別為0.3、0.6、0.9、1.5、2.5 mol/L。

通過上圖的數(shù)據(jù)可知,尿素還原峰電位為0.279～0.301 V之間,均負(fù)于生乳(0.550 V)的還原電位,符合尿素特征峰的范圍之內(nèi),且峰電位隨摻雜濃度出現(xiàn)微小的負(fù)移,峰電流隨摻雜濃度呈線性關(guān)系,因此可認(rèn)為本次摻雜乳中能檢出尿素。

2.2.2 線性范圍與檢出限 在含尿素的生乳樣品中,當(dāng)尿素濃度為0.3～2.5 mol/L的范圍內(nèi),尿素的特征峰在0. 279～0. 301 V之間,且峰電流與尿素的濃度呈線性關(guān)系,其線性方程為:Ipc=7.7847+3.3098C/(mol/L),r=0.9945,此實(shí)驗(yàn)生乳樣品中尿素的檢出限為0.171 mol/L。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)測定的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性 用同一根金電極作為工作電極,在含尿素0.9 mol/L的生乳樣品提取液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,結(jié)果表明陰極峰電流的平均值為1.1046×10-5A,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.827%,說明電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好。

2.3三氯乙酸對尿素的干擾

將含2.5 mol/L尿素的三氯乙酸溶液同生乳樣本中尿素檢測的方法處理后進(jìn)行循環(huán)伏安掃描研究,結(jié)果表明三氯乙酸與尿素混合液的電化學(xué)特性曲線和尿素特征曲線無關(guān)(見圖5)。

圖5 三氯乙酸-尿素混合液的循環(huán)伏安圖Fig.5 Cyclic Voltammograms curve of trichloroacetic acid-urea mixture

2.4此法與其他方法性能比較

通過表1的幾種方法比較發(fā)現(xiàn),在相似范圍內(nèi)的檢出限中,本文所使用的方法成本較低,預(yù)處理簡單,此法可以較好的運(yùn)用于實(shí)際生產(chǎn)線中。

3 結(jié)論

本研究以金電極為工作電極,采用循環(huán)伏安法檢測尿素及其摻在生乳中的電化學(xué)特性,通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知當(dāng)濃度為0.3～2.5 mol/L的范圍之內(nèi),尿素在金電極上發(fā)生還原反應(yīng),還原峰在0.279～0.301 V(vs. Ag/AgCl)之間,且峰電位隨濃度升高而出現(xiàn)微小的負(fù)移,峰電流與尿素的濃度呈正比,根據(jù)此峰是否出現(xiàn)及峰電流大小對生乳樣品中尿素進(jìn)行初步判別并進(jìn)行量化分析。與其他測定方法比較,此法的樣品預(yù)處理簡單、測定速度快、成本低,能較好的運(yùn)用于實(shí)際生產(chǎn)線。

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