槲皮素在多壁碳納米管修飾碳糊電極上的電化學(xué)行為及其與脫氧核糖核酸的相互作用

尚永輝，孫家娟，周 琴，毛 茹，商 娟

（咸陽師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，咸陽712000）

槲皮素又稱槲皮黃素或櫪精，屬黃酮類有機(jī)化合物，廣泛存在于蔬菜、水果以及谷類植物中，具有祛痰、止咳、平喘，降血脂、擴(kuò)張冠狀動脈和增加冠脈血流量等多種功效［1］。近年的研究發(fā)現(xiàn)：其在抗人類免疫缺陷病毒（HIV）以及抗癌等方面也具有一定的潛在藥理作用，特別在前列腺癌的治療方面效果顯著［2］。

脫氧核糖核酸（DNA）是生物界遺傳信息的數(shù)據(jù)庫，生物的發(fā)育和生命的基體機(jī)能正常運(yùn)轉(zhuǎn)是通過DNA來指導(dǎo)的，同時DNA也是組成遺傳命令的主體［3］。DNA是由很多組分組成的一條長鏈聚合物，藥物分子和DNA作用之后會改變DNA長鏈的序列，從而在一定程度上改變了DNA的性質(zhì)。DNA是抗癌藥物分子在人體內(nèi)作用的靶標(biāo)物，近年來，藥物分子與DNA作用的研究十分廣泛。

本工作探究了槲皮素在多壁碳納米管修飾碳糊電極上的電化學(xué)行為，并研究了槲皮素與DNA的相互作用。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

CHI 660C型電化學(xué)工作站；CH 2250型電子天平；DZX－3型真空干燥箱；KQ 520DE型數(shù)控超聲波清洗器；三電極系統(tǒng)：多壁碳納米管修飾碳糊電極為工作電極，Hg／Hg2Cl2為參比電極，鉑電極為輔助電極。

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：1．00×10－3mol·L－1，稱取槲皮素0．015 1g，用熱乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，備用。

DNA 溶 液：604mg· L－1，稱 取 DNA 0．030 2g，用水在50mL燒杯里攪拌至完全溶解，再轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用水定容，搖勻，備用。

中性紅溶液：1．00×10－3mol·L－1，稱取中性紅粉末0．014 4g，用水溶解，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用水定容，搖勻，備用。

試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 電極的制備

取石墨粉適量于研缽中，逐滴加入液體石蠟適量并充分研磨至混合物呈有韌性的小片狀，夯實(shí)填充入0．5mL注射器中。將打磨后的銅絲從尾端插入作為電極的導(dǎo)線，另一端打磨拋光至鏡面，制得裸碳糊電極。

稱取多壁碳納米管粉末5mg于試管中，加入二甲基甲酰胺（DMF）適量，用數(shù)控超聲波超聲分散2h，使其均勻分散，制得多壁碳納米管DMF懸浮液。移取上述懸浮液10μL，滴至制備好的裸碳糊電極表面，倒立放置，自然晾干，制得多壁碳納米管修飾碳糊電極。

1．2．2 電化學(xué)測定

移取 pH 3．29 的 B－R 緩沖溶液 3．00mL 于10mL比色管中，加入槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，用水定容至10mL，搖勻，以多壁碳納米管修飾碳糊電極為工作電極，用三電極系統(tǒng)測定循環(huán)伏安曲線和差分脈沖曲線。

2 結(jié)果與討論

2．1 槲皮素的電化學(xué)特性

移取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，分別用裸碳糊電極和多壁碳納米管修飾碳糊電極作為工作電極，按試驗(yàn)方法進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃描速率為0．30V·s－1，結(jié)果見圖1。

圖1 不同電極的循環(huán)伏安圖Fig．1 CVs of different electrodes

由圖1可知：槲皮素在裸碳糊電極上產(chǎn)生一個較為明顯的氧化峰，無明顯還原峰出現(xiàn)；槲皮素在多壁碳納米管修飾碳糊電極上產(chǎn)生一對明顯的氧化還原峰，峰電位分別為0．488，0．348V，且氧化峰的電流信號明顯強(qiáng)于裸碳糊電極上的氧化峰電流信號（約為裸碳糊電極上電流信號的5．3倍），這表明多壁碳納米管對槲皮素有很好的催化作用。

2．2 試驗(yàn)條件的選擇

2．2．1 酸 度

試驗(yàn)考察了酸度對槲皮素電化學(xué)信號的影響。槲皮素在不同pH的B－R緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖見圖2，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為2．00×10－4mol·L－1，掃描速率為0．30V·s－1。

圖2 槲皮素在不同pH的B－R緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖Fig．2 CVs of quercetin in B－R buffer solution with different pH

由圖2可知：隨著pH增加，槲皮素的氧化峰線性負(fù)移，峰電位（Ep）與pH的線性回歸方程為Ep＝－0．066 42pH＋0．747 4，相關(guān)系數(shù)為0．996 6，表明有質(zhì)子參與槲皮素在多壁碳納米管修飾碳糊電極上的反應(yīng)過程，依據(jù)峰電位與pH之間的公式：

式中：m為質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)；E0為標(biāo)準(zhǔn)電極電位；n為電子轉(zhuǎn)移數(shù)。計(jì)算得m／n＝1．122≈1，即m＝n，表明該電極反應(yīng)為等質(zhì)子等電子參與過程［4］。

pH為3．29時，槲皮素氧化峰電流最大，峰形最佳，試驗(yàn)選擇反應(yīng)體系的pH為3．29。

2．2．2 底液

試驗(yàn)考察了槲皮素分別在pH為3．29的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖溶液、B－R緩沖溶液、鄰苯二甲酸氫鉀－鹽酸、乙酸－乙酸鈉、磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液等5種底液中的電化學(xué)信號，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為2．00×10－4mol·L－1，掃描速率為0．30V·s－1，底液對電化學(xué)性質(zhì)的影響見圖3。

圖3 底液對電化學(xué)性質(zhì)的影響Fig．3 Effect of based liquid on electrochemical properties

由圖3可知：槲皮素在pH 3．29的B－R緩沖溶液中氧化峰電流最大，峰形最好。試驗(yàn)選擇pH為3．29的B－R緩沖溶液為底液。

2．2．3 掃描速率

移取1．00×10－3mol·L－1槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液2．00mL于pH 3．29的B－R緩沖溶液中，用多壁碳納米管修飾碳糊電極為工作電極，在最佳電位下改變掃描速率，記錄循環(huán)伏安曲線，掃描速率對電化學(xué)性質(zhì)的影響見圖4。

由圖4可知：隨掃描速率增加，槲皮素的氧化峰電流逐漸增加，峰電位逐漸正移。試驗(yàn)選擇掃描速率為0．30V·s－1。

圖4 掃描速率對電化學(xué)性質(zhì)的影響Fig．4 Effect of scanning rates on electrochemical properties

試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，0．488V左右的氧化峰電流與其對應(yīng)的掃描速率呈線性關(guān)系，線性回歸方程為I＝－18．81 v－3．903，相關(guān)系數(shù)為0．997 0。這表明槲皮素在修飾電極表面的電極反應(yīng)受吸附控制。

氧化峰電位對掃描速率的線性回歸方程為Ep＝0．022 3lnv＋0．478 6，相關(guān)系數(shù)為0．996 5。根據(jù)公式（2）：

式中：α為電子轉(zhuǎn)移系數(shù)；k為電極反應(yīng)速率常數(shù)；F為法拉第常數(shù)；Eθp為標(biāo)準(zhǔn)峰電位；R為摩爾氣體常數(shù)；T 為熱力學(xué)溫度。α取0．5［5］，得到n＝2．30≈2，結(jié)合2．2．1節(jié)電極反應(yīng)為等質(zhì)子等電子參與過程，可知槲皮素在多壁碳納米管修飾碳糊電極上的電化學(xué)反應(yīng)過程為2質(zhì)子2電子參與轉(zhuǎn)移的過程，槲皮素在多壁碳納米管修飾碳糊電極上的電極反應(yīng)過程見圖5。

圖5 電極反應(yīng)過程Fig．5 Process of electrode reaction

根據(jù)文獻(xiàn)［6］可知：在循環(huán)伏安曲線上觀察到槲皮素在約0．88V和約0．20V處的較小的峰電流（Ip）可能是槲皮素結(jié)構(gòu)式中C3位上的－OH反應(yīng)引起的。

2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

按試驗(yàn)方法測定了槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的差分脈沖曲線，結(jié)果表明：槲皮素的濃度在5．00×10－7～5．00×10－5mol·L－1內(nèi)與其對應(yīng)的差分脈沖伏安電流呈線性關(guān)系，線性回歸方程為－i＝8 472 c＋8．720，相關(guān)系數(shù)為0．999 7，檢出限為2．00×10－7mol·L－1。

2．4 槲皮素與DNA的相互作用

2．4．1 槲皮素與DNA相互作用的電化學(xué)方法

移取pH 3．29的 B－R 緩沖溶液2．00mL于比色管中，加入一定量的1．00×10－3mol·L－1槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和一定量的DNA溶液，用水定容至10mL，搖勻，靜置60min，使其充分反應(yīng)。以多壁碳納米管修飾電極為工作電極的三電極系統(tǒng)進(jìn)行測定，記錄循環(huán)伏安曲線和差分脈沖曲線，DNA對槲皮素電化學(xué)行為的影響見圖6。

圖6 DNA對槲皮素電化學(xué)行為的影響Fig．6 Effect of DNA on electrochemical behavior of quercetin

由圖6（a）可知：隨著DNA質(zhì)量濃度的增加，槲皮素的氧化峰、還原峰電流均依次減小，其中氧化峰逐漸正移，還原峰逐漸負(fù)移，氧化峰正移程度大于還原峰負(fù)移程度，表明隨著DNA的加入，槲皮素峰電位明顯正移。根據(jù)文獻(xiàn)［7］總結(jié)的相互作用規(guī)律，推測槲皮素主要通過嵌入方式與DNA產(chǎn)生相互作用。圖6（b）也觀察到一致的現(xiàn)象：隨著DNA的加入，峰電流減小了21．1%（曲線1～5），峰電位正移了13mV（曲線1的0．410V到曲線5的0．423V）。從結(jié)構(gòu)上看：槲皮素的主體結(jié)構(gòu)有5個羥基，屬親水基團(tuán)，易與DNA上的堿基對發(fā)生相互作用。

2．4．2 以中性紅為探針研究槲皮素與DNA的相互作用

中性紅能與DNA發(fā)生嵌插作用［8］。為了進(jìn)一步探究槲皮素與DNA的相互作用過程，試驗(yàn)以中性紅為探針進(jìn)行研究。在pH 3．29的B－R緩沖溶液中，分別加入一定量的中性紅溶液，中性紅與DNA的混合溶液，中性紅、DNA和槲皮素的混合溶液，分別靜置反應(yīng)30min后，按試驗(yàn)方法以多壁碳納米管修飾碳糊電極為工作電極測定差分脈沖曲線和紫外－可見吸收光譜。中性紅、DNA及槲皮素反應(yīng)的差分脈沖曲線和紫外－可見吸收光譜見圖7。

圖7 中性紅、DNA及槲皮素反應(yīng)的差分脈沖曲線和紫外－可見吸收光譜Fig．7 DPVs and UV－Vis adsorption spectra of neutral red，DNA dn quercetin

由圖7（a）可知：中性紅在－0．268V處具有一靈敏的氧化峰（曲線1）；加入DNA后，由于中性紅與DNA的結(jié)合導(dǎo)致體系中中性紅的濃度降低，從而使中性紅氧化峰電流隨之降低（曲線2）；當(dāng)體系中加入槲皮素后，中性紅的峰電流又明顯增強(qiáng)（曲線3）。圖7（b）也得到了相同的試驗(yàn)結(jié)果。這應(yīng)該是由于槲皮素、中性紅兩者與DNA的相互作用過程具有相同的作用方式和作用位點(diǎn)?；旌先芤褐虚纹に嘏c中性紅相互競爭與DNA相結(jié)合，加入的槲皮素通過競爭導(dǎo)致插進(jìn)DNA雙鏈的堿基對中的中性紅分子被游離出來，因此體系中游離的中性紅濃度增加，導(dǎo)致中性紅的氧化峰電流和吸光度增加。據(jù)此可以判斷槲皮素與中性紅類似能有效插進(jìn)DNA雙鏈的堿基對中，與DNA發(fā)生嵌插作用的結(jié)合。

本方法靈敏度高、檢出限低，可作為槲皮素測定的新方法。

［1］ 孫涓，余世春．槲皮素的研究進(jìn)展［J］．現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2011，25（3）：85－88．

［2］ 翟廣玉，馬海英，郜蕾．槲皮素及其衍生物的抗腫瘤活性研究進(jìn)展［J］．化學(xué)試劑，2015，37（2）：97－103．

［3］ 黃振興，李晨晨，金旭琴，等．除藻劑新潔爾滅與鯡魚精子DNA的相互作用［J］．環(huán)境化學(xué)，2016，35（8）：1636－1641．

［4］ ZHU Y H，ZHANG Z L，PANG D W．Electrochemical oxidation of theophylline at multi－wall carbon nanotube modified glassy carbon electrodes［J］．Journal of Electroanalytical Chemistry，2005，581（2）：303－309．

［5］ 李玲，王娟，劉計(jì)敏，等．L－半胱氨酸／納米金／DNA／殼聚糖修飾金電極測定布洛芬［J］．分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，32（5）：644－648．

［6］ 余從立．槲皮素的電分析與電氧化機(jī)理研究［D］．合肥：合肥工業(yè)大學(xué)，2006．

［7］ CARTER MICHAEL T，BARD ALLEN J．Voltammetric studies of the interaction of tris（1，10－phenanthroline）cobalt（III）with DNA［J］．J Am Chem Soc，1987，109（24）：7528－7530．

［8］ 楊昌英，汪鋆植，代忠旭，等．以中性紅為電化學(xué)探針考察根皮苷、根皮素與DNA的作用［J］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009（21）：221－224．