河南省雞源糞腸球菌的分離鑒定與耐藥性分析

朱雷，李金磊，董鵬，狄元冉，鞏丹，張?jiān)霾?/p>

（河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450008）

腸球菌原屬于鏈球菌屬，1994年正式被獨(dú)立為腸球菌屬[1]。糞腸球菌是一種革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界中，常棲居于人和動(dòng)物的腸道中，在畜牧業(yè)中糞腸球菌常作為益生菌飼料添加劑來調(diào)節(jié)畜禽腸道菌群，是重要的條件致病菌[2]。近年來，隨著抗菌藥物和免疫制劑的廣泛使用和侵入性治療機(jī)會(huì)的增加，使得糞腸球菌成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一[3]，我國醫(yī)院分離的病原菌中，糞腸球菌位居前3位[4]。在獸醫(yī)臨床研究中，由腸球菌引起的動(dòng)物疾病也日益增多[5],豬和雞感染糞腸球菌發(fā)病以及死亡的報(bào)道也越來越多[6-7]。據(jù)研究顯示，多重耐藥性在腸球菌中已普遍存在，并且變得日益嚴(yán)重[8]，這給人畜臨床抗感染治療帶來極大的挑戰(zhàn)。作為可以衡量抗菌藥物耐藥性水平的革蘭氏陽性指示菌，對(duì)雞源糞腸球菌的耐藥性分析和研究是極其重要的，可以為科學(xué)制定抗菌感染防治方案以及細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)提供必要的理論依據(jù)。該試驗(yàn)從河南省A、B、C、D4個(gè)地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)抽取樣品進(jìn)行糞腸球菌分離、鑒定，隨后進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，以期掌握河南省雞源糞腸球菌的耐藥情況，為以后的臨床用藥和糞腸球菌的控制預(yù)防提供科學(xué)指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29212，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 樣品來源

2016年1月至12月抽取河南省A、B、C、D4個(gè)地區(qū)規(guī)?；u場(chǎng)肛門拭子樣品180批。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定板、一次性無菌采樣棒（BHI）、K-F鏈球菌瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、腦心浸液瓊脂、革蘭氏陽性細(xì)菌藥敏板。

1.1.4 儀器設(shè)備

低溫可疊放搖床、細(xì)菌濁度儀、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)、梯度PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.5 引物

糞腸球菌引物P1：5'-ACTTATGTGACTAAC TTAACC-3'，P2：5'-TAATGGTGAATCTTGGTTTGG-3'，擴(kuò)增片段長度為326bp。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)增菌

將一次性無菌采樣棒采集的樣品盡快送到實(shí)驗(yàn)室，37℃培養(yǎng)16～20h，同時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照。1.2.2 樣品的分離、純化

取預(yù)增菌菌液1～2環(huán)，劃線于K-F鏈球菌瓊脂上，37℃培養(yǎng)（48±2）h，選取單個(gè)典型菌落進(jìn)行純化，最后將純化好的菌落劃線接種于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 PCR鑒定 用滅菌棉簽挑取純化好的菌落，加入裝有無菌生理鹽水的1.5ml離心管中，反復(fù)冷凍煮沸2～3次，12000rpm離心取上清液作為PCR擴(kuò)增模板。同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

50μl總反應(yīng)體系為：預(yù)混酶 25μl ddH2O 18μl P1 1μl P2 1μl模板 5μl

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5min；4℃保存。同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

PCR結(jié)束后，取8μlPCR產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖進(jìn)行電泳，15V/cm電泳20～30min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3.2 鑒定系統(tǒng)鑒定 對(duì)PCR鑒定為糞腸球菌陽性的

樣品，采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

取營養(yǎng)瓊脂上經(jīng)鑒定的糞腸球菌菌落，用生理鹽水調(diào)制0.5MCF，吸取10μl加入到10ml肉湯中，然后分別取100μl加入到96孔藥敏板中，37℃培養(yǎng)16～20h，讀取藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離結(jié)果

經(jīng)預(yù)增菌培養(yǎng)，KF鏈球菌瓊脂分離純化，最后經(jīng)PCR及全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)鑒定，河南地區(qū)規(guī)?；u場(chǎng)共分離糞腸球菌100株，分離率為55.6%，其中A、B、C、D4個(gè)地區(qū)分離率分別為70.00%（21/30）、38.90%（35/90）、90.00%（27/30）、56.70%（17/30）。具體情況見表1。

表1 2016年河南省各地區(qū)雞源場(chǎng)糞腸球菌分離情況

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離的100株糞腸球菌對(duì)克林霉素、泰妙菌素、青霉素、頭孢西丁、磺胺異惡唑、替米考星、紅霉素耐藥較嚴(yán)重，耐藥率分別為100.00%、100.00%、100.00%、98.81%、97.62%、94.05%、92.86%；對(duì)頭孢噻呋、強(qiáng)力霉素（多西環(huán)素）、氧氟沙星耐藥相對(duì)嚴(yán)重，耐藥率均在60%～90%；對(duì)萬古霉素全部敏感。

2.3 不同地區(qū)耐藥結(jié)果

不同地區(qū)耐藥結(jié)果存在差異，A地區(qū)耐藥率較其他地區(qū)偏高，A、C地區(qū)對(duì)強(qiáng)力霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、復(fù)方新諾明的耐藥率明顯高于B、D地區(qū)，D地區(qū)對(duì)頭孢噻呋的耐藥率明顯低于A、B、C地區(qū)，A、B地區(qū)對(duì)慶大霉素的耐藥率明顯高于C、D地區(qū)。具體結(jié)果見表2。

表2 河南省2016年不同地區(qū)雞源糞腸球菌耐藥情況

3 討論

糞腸球菌很易被誘導(dǎo)產(chǎn)生新的耐藥性，并且對(duì)許多抗菌藥物可以產(chǎn)生獲得性耐藥，如對(duì)高水平的氨基糖苷、糖肽類(萬古霉素)、β-內(nèi)酰胺、紅霉素、四環(huán)素、利福平等，耐藥菌株的感染使常規(guī)性治療難以奏效[9]。

該研究通過對(duì)河南省規(guī)?；u場(chǎng)的糞腸球菌進(jìn)行分離純化、鑒定以及耐藥性試驗(yàn)，共分離糞腸球菌100株，分離率55.60%，與黃雁[10]等研究的福建某雞場(chǎng)的糞腸球菌分離率為77.80%相比，相對(duì)較低，比蘇崴藝[11]等從遼寧省雞場(chǎng)分離率為24.00%要高。這種分離率存在差異，可能是由地區(qū)不同、采樣時(shí)間不同導(dǎo)致的，也可能是不同養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境差異及用藥情況不同所致。

分離的100株糞腸球菌對(duì)克林霉素、泰妙菌素、青霉素、頭孢西丁、磺胺異惡唑、替米考星、紅霉素耐藥較嚴(yán)重，耐藥率均超過90.00%；對(duì)頭孢噻呋、強(qiáng)力霉素（多西環(huán)素）、氧氟沙星耐藥相對(duì)嚴(yán)重，未發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素菌株。這一結(jié)果比張慧[12]等研究的雞源糞腸球菌對(duì)紅霉素、慶大霉素的耐藥率分別為90.00%和23.70%略高（該試驗(yàn)結(jié)果分別為92.86%和36.90%）；比商軍[13]等研究的雞源糞腸球菌對(duì)青霉素、紅霉素、慶大霉素的耐藥率分別為91.30%、91.30%和26.10%略高，（該試驗(yàn)結(jié)果分別為100.00%、92.86%和36.90%）。這種耐藥率的差異，表明不同動(dòng)物來源其耐藥率存在差異，不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖環(huán)境、不同用藥情況均可導(dǎo)致其耐藥率不同。

從該次試驗(yàn)結(jié)果看，河南省雞源性糞腸球菌耐藥現(xiàn)象已相對(duì)較為嚴(yán)重，在今后的管理過程中，應(yīng)引導(dǎo)養(yǎng)殖企業(yè)規(guī)范用藥，合理用藥，營造更好的養(yǎng)殖環(huán)境，進(jìn)一步控制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

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