小角X射線散射波譜的定量作圖分析法在作物淀粉研究中的應(yīng)用

何 巍 范孝旭 王志峰 韋存虛,

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小角X射線散射波譜的定量作圖分析法在作物淀粉研究中的應(yīng)用

何 巍1范孝旭1王志峰2韋存虛1,*

1揚(yáng)州大學(xué) / 江蘇省作物遺傳生理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)/ 糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇揚(yáng)州 225009;2揚(yáng)州大學(xué)測(cè)試中心, 江蘇揚(yáng)州 225009

用小角X射線散射(small-angle X-ray scattering, SAXS)波譜可以定量分析淀粉的片層結(jié)構(gòu), 但缺乏波譜數(shù)據(jù)分析軟件而且需要專業(yè)的數(shù)學(xué)公式推導(dǎo), 嚴(yán)重制約了SAXS在淀粉研究中的應(yīng)用。本文建立了一種簡(jiǎn)單的作圖分析方法, 可定量測(cè)定SAXS波譜中的淀粉片層結(jié)構(gòu)信息(峰強(qiáng)度、峰位置、半峰寬度和片層距離)。我們用該方法定量測(cè)定了不同晶體類型淀粉、不同直鏈淀粉含量的水稻淀粉、酸不溶淀粉和熱不溶淀粉的SAXS波譜參數(shù)。結(jié)果表明, 片層結(jié)構(gòu)與淀粉的植物來(lái)源有關(guān), 而與淀粉晶體類型沒(méi)有直接的相關(guān)性。相同植物來(lái)源的淀粉, 其直鏈淀粉含量與SAXS峰強(qiáng)度和半峰寬度呈顯著負(fù)相關(guān)而與片層距離呈正相關(guān)。酸水解不影響淀粉片層厚度, 但明顯改變片層峰強(qiáng)度和半峰寬度。加熱處理也不影響淀粉片層厚度, 但破壞淀粉晶體結(jié)構(gòu)導(dǎo)致片層峰強(qiáng)度隨溫度升高逐漸降低直至消失。該定量作圖分析法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、可信度高, 可以在作物淀粉研究中廣泛應(yīng)用。

作物淀粉; 小角X射線散射波譜; 波譜參數(shù); 定量作圖分析法; 片層結(jié)構(gòu)

淀粉是葡萄糖單元聚合而成的天然高分子化合物, 由直鏈淀粉和支鏈淀粉組裝形成包含半晶體和無(wú)定形區(qū)域的顆粒結(jié)構(gòu), 一般分布在植物的種子、塊根和塊莖等貯藏組織中, 但也有少部分存在于植物的葉、莖、果實(shí)和花粉中。根據(jù)分子的鏈結(jié)構(gòu)和聚集態(tài)結(jié)構(gòu), 一般可將淀粉結(jié)構(gòu)分為5個(gè)層次, 即淀粉的顆粒結(jié)構(gòu)(granule, 2~100 μm)、生長(zhǎng)環(huán)結(jié)構(gòu)(growth ring, 120~150 nm)、“止水塞”結(jié)構(gòu)(blocklet, 20~500 nm)、無(wú)定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)構(gòu)成的片層結(jié)構(gòu)(amorphous and crystalline lamellae, 8~11 nm)、支鏈淀粉和直鏈淀粉分子鏈結(jié)構(gòu)(amylopectin and amylose chains, 0.1~1.0 nm)[1-2]。淀粉顆粒懸浮于水中, 在光學(xué)顯微鏡下呈現(xiàn)明暗相間的環(huán)帶被稱為生長(zhǎng)環(huán)(growth ring), 分為半晶體生長(zhǎng)環(huán)(semi-crystalline growth ring)和無(wú)定形生長(zhǎng)環(huán)(amorphous growth ring)。半晶體生長(zhǎng)環(huán)不易水解, 其厚度為120~400 nm, 由許多交替排列的9~10 nm基本單位構(gòu)成, 每個(gè)基本單位都由晶體片層(crystalline lamella, 5~6 nm)和無(wú)定形片層(amorphous lamella, 2~5 nm)組成[3]?！爸顾苯Y(jié)構(gòu)是由多個(gè)交替排列的晶體片層和無(wú)定形片層組成的球形結(jié)構(gòu), 其大小介于生長(zhǎng)環(huán)與片層結(jié)構(gòu)之間。一般認(rèn)為, 支鏈淀粉分子側(cè)鏈以雙螺旋的形式組裝成晶格, 形成晶體片層; 而直鏈淀粉分子和支鏈淀粉分子的分支點(diǎn)形成無(wú)定形片層[4]。無(wú)定形生長(zhǎng)環(huán)容易被水解, 主要成分是直鏈淀粉, 其厚度不低于半晶體生長(zhǎng)環(huán)[5]。

淀粉晶體片層與無(wú)定形片層交替排列構(gòu)成半晶體生長(zhǎng)環(huán)的基本重復(fù)單元, 而基本單元的尺寸進(jìn)一步反映半晶體生長(zhǎng)環(huán)的尺寸, 其中片層結(jié)構(gòu)排列的一致性也反映淀粉內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序程度。研究淀粉片層結(jié)構(gòu)有助于了解其結(jié)構(gòu)特征、理解其亞或超分子聚合結(jié)構(gòu)與淀粉特性的關(guān)系, 從而在作物品種培育和淀粉利用上提供重要信息[6]。目前研究淀粉片層結(jié)構(gòu)主要依靠小角X射線散射(small-angle X-ray scattering, SAXS)技術(shù), 該技術(shù)能夠準(zhǔn)確地探測(cè)物質(zhì)內(nèi)部幾納米至幾百納米范圍的結(jié)構(gòu)。淀粉SAXS波譜有一個(gè)主散射峰, 峰的位置與層狀排列的結(jié)晶和無(wú)定形區(qū)域的平均總厚度相關(guān)[7]。此外, 峰強(qiáng)度取決于有序半結(jié)晶結(jié)構(gòu)的量和/或相對(duì)于無(wú)定形背景的晶體和無(wú)定形薄片之間的電子密度差異[8]。峰的面積主要取決于淀粉半結(jié)晶區(qū)域的有序度[9]。目前對(duì)于該散射峰的分析主要基于原子物理學(xué)的公式擬合分析, 其操作不僅繁瑣復(fù)雜, 而且需要專業(yè)的數(shù)學(xué)和軟件編程專家共同參與才能完成, 嚴(yán)重制約了SAXS技術(shù)在淀粉研究中的應(yīng)用。

為了促進(jìn)SAXS技術(shù)在作物淀粉研究中的應(yīng)用, 我們建立了一種簡(jiǎn)單方便的圖形分析法, 用來(lái)定量獲得SAXS波譜參數(shù)信息。我們利用該方法定量測(cè)定了不同晶體類型的植物淀粉、不同直鏈淀粉含量的水稻淀粉、酸水解和糊化的蓮藕淀粉的SAXS波譜參數(shù), 并分析了淀粉片層結(jié)構(gòu)信息參數(shù)與淀粉晶體類型、直鏈淀粉含量、酸水解和糊化的關(guān)系。該研究結(jié)果為SAXS技術(shù)在作物淀粉研究中的應(yīng)用提供重要的參考作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻(L.)品種特青(Teqing)、龍?zhí)馗?Longtefu)、黃華占(Huanghuazhan)、桂花黃(Guihuahuang)、9311、日本晴(Nipponbare)、武香9915 (Wuxiang 9915)、武運(yùn)粳8號(hào)(Wuyunjing 8)和玉米(L.)品種鄭單958 (Zhengdan 958)的成熟種子采收于揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)田, 由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院劉巧泉教授提供。馬鈴薯(L.)塊莖、蓮藕(Gaertn.)根狀莖、山藥(Thunb.)根狀莖、土茯苓(Roxb.)根狀莖采購(gòu)于揚(yáng)州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 天然淀粉分離

參照Cai等[10]方法分離水稻淀粉, 參照Lin等[11]方法分離玉米淀粉, 參照Cai等[12]和Man等[13]方法分離馬鈴薯、蓮藕、山藥和土茯苓淀粉。

1.3 酸不溶蓮藕淀粉制備

參照Cai等[14]方法制備酸不溶蓮藕淀粉。將2 g天然蓮藕淀粉懸浮于100 mL 2.2 mol L–1HCl溶液中, 于40°C分別水解4、8、12、16、24、36、48和72 h, 每天用手輕輕搖動(dòng)3次以懸浮淀粉。水解結(jié)束后, 離心(5000×, 10 min)獲得未水解淀粉殘留物。將殘留的淀粉用雙蒸水清洗4次, 無(wú)水乙醇洗滌2次, 40°C干燥2 d, 然后被研磨成粉末, 過(guò)100目篩備用。

1.4 熱不溶蓮藕淀粉制備

參照Cai等[15]方法制備熱不溶蓮藕淀粉。將1 g天然蓮藕淀粉懸浮于40 mL雙蒸水中, 以1°C min–1的速度從室溫加熱至100°C, 期間每5 min用手搖動(dòng)一次以懸浮淀粉沉淀。在50~100°C范圍內(nèi), 每隔5°C將加熱的淀粉取出, 立即放入冰浴中冷卻, 4°C離心(5000×, 10 min)獲得未溶解的淀粉沉淀。沉淀經(jīng)雙蒸水清洗4次, 無(wú)水乙醇洗滌2次, 40°C干燥2 d, 然后被研磨成粉末, 過(guò)100目篩備用。

1.5 淀粉SAXS波譜采集

采集淀粉SAXS波譜參考Yuryev等[8]方法并作一些修改。將天然、酸不溶和熱不溶淀粉浸沒(méi)在去離子水中, 4°C過(guò)夜, 5000×離心10 min, 棄上清液獲得淀粉漿。用Bruker NanoStar型小角X射線散射儀分析, 采用Vantec 2000檢測(cè)器和針孔準(zhǔn)直技術(shù), X射線源為銅旋轉(zhuǎn)陽(yáng)極(直徑0.1 mm), 電壓50 kV, 功率30 W, 裝有交叉耦合Gobel鏡, 產(chǎn)生波長(zhǎng)為1.5418 ?的Cu Kα射線。光學(xué)部件和樣品室均處于真空狀態(tài), 以減少空氣散射。在X射線散射分析時(shí), 保證淀粉漿在密封的容器內(nèi), 以防止水分散失。用DIFFRACplusNanoFit軟件處理SAXS波譜, 獲得波譜原始數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差, 用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析(Tukey法,<0.05)和皮爾遜雙變量相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉SAXS波譜定量作圖分析方法的建立

利用SAXS波譜數(shù)據(jù)中的散射角和散射強(qiáng)度數(shù)據(jù)作圖, 并利用Photoshop圖形軟件進(jìn)行波譜參數(shù)的定量測(cè)定(圖1), 詳細(xì)過(guò)程如下。(1)作圖前先將導(dǎo)出的波譜數(shù)據(jù)中的散射強(qiáng)度進(jìn)行等比例調(diào)整, 將所有樣品數(shù)據(jù)以q = 0.2 ?–1處的散射強(qiáng)度為20作基準(zhǔn), 以排除樣品之間淀粉濃度的差異。(2)利用常規(guī)數(shù)據(jù)作圖軟件(如Excel, Origin), 以散射角度(0.015~0.15 ?–1)為橫坐標(biāo), 散射強(qiáng)度(0~1000)為縱坐標(biāo)建立SAXS波譜圖。(3)利用Photoshop圖形軟件打開(kāi)波譜圖, 選取Photoshop直線工具, 繪制一條與波譜峰底部?jī)蓚?cè)相切的基線(直線AB)。(4)從波譜峰最高點(diǎn)向X軸繪制一條垂直的峰位置線(線段CD)。(5)峰最高點(diǎn)至基線之間的峰位置線線段為峰強(qiáng)度線(線段CE)。(6)在峰強(qiáng)度線一半處(交點(diǎn)F)繪制與基線平行并與波譜峰兩側(cè)相交的線段為半峰寬線(線段GH)。(7)利用Photoshop測(cè)量工具, 測(cè)量峰強(qiáng)度線線段CE的長(zhǎng)度與縱坐標(biāo)線段IJ的長(zhǎng)度, 其中線段IJ的選取可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行調(diào)整, 圖1中線段IJ選取的長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)的散射強(qiáng)度差值為200。(8)根據(jù)線段CE和線段IJ長(zhǎng)度的比值, 并參考線段IJ對(duì)應(yīng)的散射強(qiáng)度差值, 換算成峰強(qiáng)度(Imax= CE/IJ×200)。(9)利用Photoshop信息工具, 獲取交點(diǎn)G對(duì)應(yīng)于畫(huà)布的橫向標(biāo)尺刻度值(XG)和交點(diǎn)H對(duì)應(yīng)于畫(huà)布的橫向標(biāo)尺刻度值(XH), 而兩者的差值(XH-XG)即為線段GH的水平投影長(zhǎng)度。(10)測(cè)量橫坐標(biāo)線段KL長(zhǎng)度, 其中線段KL的選取可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行調(diào)整, 圖1中線段KL選取的長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)的散射角度差值為0.02 ?–1。(11)根據(jù)線段GH的水平投影長(zhǎng)度和線段KL長(zhǎng)度的比值, 并參考線段KL對(duì)應(yīng)的散射角度差值, 換算成半峰寬[ΔS = (XH-XG)/KL×0.02 ?–1]。(12)利用Photoshop測(cè)量工具, 測(cè)量坐標(biāo)原點(diǎn)(O)至峰位置線的水平距離(線段OD的長(zhǎng)度), 并參考橫坐標(biāo)原點(diǎn)值(0.015 ?–1)和線段KL對(duì)應(yīng)的散射角度差值(0.02 ?–1), 換算出波譜峰對(duì)應(yīng)的散射角度(Smax= 0.015+OD/ KL×0.02 ?–1)。(13)根據(jù)公式(d = 2π/Smax)[8-9], 計(jì)算淀粉半晶體片層的厚度(d)。

圖1 淀粉SAXS波譜定量作圖分析方法示意圖

2.2 不同晶體類型淀粉的SAXS波譜參數(shù)

根據(jù)X-射線衍射波譜可將不同植物來(lái)源的淀粉分為A-、B-和C-型晶體淀粉[16]。為了分析淀粉片層結(jié)構(gòu)與晶體類型的關(guān)系, 本文選取水稻和玉米淀粉代表A-型晶體、馬鈴薯和土茯苓淀粉代表B-型晶體、蓮藕和山藥淀粉代表C-型晶體, 對(duì)它們的SAXS波譜(圖2)進(jìn)行定量作圖分析, 獲得的波譜參數(shù)見(jiàn)表1。6種淀粉的峰強(qiáng)度分布在157.1~357.4, 散射峰位置分布在0.061~0.068 ?–1, 半峰寬度分布在0.015~ 0.023 ?–1, 片層距離分布在9.3~10.3 nm。根據(jù)6種淀粉的波譜參數(shù)結(jié)合它們的晶體類型表明, SAXS波譜參數(shù)與淀粉晶體類型無(wú)明顯相關(guān)性, 這可能與植物的來(lái)源相關(guān)。

表1 不同植物來(lái)源淀粉的SAXS波譜參數(shù)

同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)以不同字母的數(shù)據(jù)在=0.05水平上差異顯著。a)標(biāo)準(zhǔn)偏差的值太低被省略(<0.001)。

Values followed by different letters within the same column are significantly different at the 0.05 probability level.a)The SD is omitted due to its very low value (<0.001).

圖2 不同植物來(lái)源淀粉的SAXS波譜圖

a: 土茯苓; b: 馬鈴薯; c: 山藥; d: 蓮藕; e: 玉米; f: 水稻。

a: glabrous greenbrier rhizome; b: potato; c: Chinese yam; d: lotus; e: maize; f: rice.

2.3 不同直鏈淀粉含量淀粉的SAXS波譜參數(shù)

為研究直鏈淀粉含量與淀粉片層結(jié)構(gòu)的關(guān)系, 選取不同直鏈淀粉含量的普通水稻淀粉為材料, 對(duì)它們的SAXS波譜(圖3)進(jìn)行定量作圖分析, 獲得的波譜參數(shù)見(jiàn)表2。這8種淀粉的峰強(qiáng)度分布在286.4~464.8, 散射峰位置分布在0.065~0.069 ?–1, 半峰寬度分布在0.018~0.021 ?–1, 片層距離分布在9.1~9.7 nm。以凝膠滲透色譜測(cè)得日本晴、武香9915、9311、武云粳8號(hào)、黃華占、桂花黃、龍?zhí)馗吞厍嗟矸鄣闹辨湹矸酆糠謩e為15.5%、17.5%、18.0%、18.5%、18.7%、23.3%、26.3%和26.9%[10]。相關(guān)性分析表明, 8種水稻淀粉的直鏈淀粉含量與它們的峰強(qiáng)度(=-0.803,<0.05)、峰位置(=-0.786,<0.05)和半峰寬度(=-0.787,<0.05)呈顯著負(fù)相關(guān), 而與片層距離呈顯著正相關(guān)(= 0.758,<0.05)。

2.4 酸不溶淀粉的SAXS波譜參數(shù)

利用鹽酸對(duì)蓮藕淀粉進(jìn)行酸水解, 對(duì)酸水解不同時(shí)間后的淀粉殘留SAXS波譜(圖4)進(jìn)行定量作圖分析, 獲得的波譜參數(shù)見(jiàn)表3。在整個(gè)酸水解過(guò)程中, 淀粉的散射峰位置和片層距離沒(méi)有發(fā)生變化, 半峰寬度隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。峰強(qiáng)度在水解前期逐漸增加, 其中酸水解的前4 h顯著增加, 然后在水解4 h與8 h之間緩慢增加; 水解8 h之后, 峰強(qiáng)度逐漸降低, 以至于水解48 h后看不到明顯的散射峰。這些結(jié)果表明, 在酸水解早期階段片層峰的強(qiáng)度增大, 而在酸水解的后期階段片層峰的強(qiáng)度減小。

圖3 不同直鏈淀粉含量稻米淀粉的SAXS波譜圖

a: 龍?zhí)馗? b: 桂花黃; c: 特青; d: 武香9915; e: 黃華占; f: 武運(yùn)粳8號(hào); g: 9311; h: 日本晴。

a: Longtefu; b: Guihuahuang; c: Teqing; d: Wuxiang 9915; e: Huanghuazhan; f: Wuyunjing 8; g: 9311; h: Nipponbare.

表2 不同直鏈淀粉含量水稻淀粉的SAXS波譜參數(shù)

同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)以不同字母的數(shù)據(jù)在=0.05水平上差異顯著。a)標(biāo)準(zhǔn)偏差的值太低被省略。

Values followed by different letters within the same column are significantly different at the 0.05 probability level.a)The SD is omitted due to its very low value.

表3 酸不溶蓮藕淀粉SAXS波譜參數(shù)

同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)以不同字母的數(shù)據(jù)在=0.05水平上差異顯著。a)標(biāo)準(zhǔn)偏差的值太低被省略(<0.001)。b) “—”未檢測(cè)到數(shù)據(jù)。

Values followed by different letters within the same column are significantly different at the 0.05 probability level.a)SD is omitted due to its very low value (<0.001).b) “—”data are not detected.

圖4 酸不溶蓮藕淀粉的SAXS波譜圖

2.5 熱不溶淀粉的SAXS波譜參數(shù)

淀粉在水中被加熱糊化, 晶體片層被破壞。對(duì)不同溫度處理下的淀粉SAXS波譜(圖5)進(jìn)行定量作圖分析, 獲得的波譜參數(shù)見(jiàn)表4。在整個(gè)糊化過(guò)程中, 淀粉的散射峰位置和片層距離沒(méi)有變化, 峰強(qiáng)度和半峰寬度隨溫度的升高而降低。當(dāng)溫度超過(guò)75°C時(shí), 淀粉完全被糊化, 因此無(wú)法觀察到SAXS散射峰。

表4 熱不溶蓮藕淀粉的SAXS波譜參數(shù)

同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)以不同字母的數(shù)據(jù)在=0.05水平上差異顯著。a)標(biāo)準(zhǔn)偏差的值太低被省略(<0.001)。b)“—”未檢測(cè)到數(shù)據(jù)。

Values followed by different letters within the same column are significantly different at the 0.05 probability level.a)SD is omitted due to its very low value (<0.001).b)“—”: data are not detected.

圖5 熱不溶蓮藕淀粉的SAXS波譜圖

3 討論

淀粉SAXS波譜在散射角度為0.06 ?–1附近出現(xiàn)一個(gè)明顯的主散射峰, 被認(rèn)為是由支鏈淀粉側(cè)鏈形成的交替排列的晶體和無(wú)定形片層結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的[9]。峰的位置取決于片層的大小, 并且在不同植物淀粉中可能不同, 而峰強(qiáng)度和峰面積主要取決于淀粉半結(jié)晶區(qū)域的有序度[9]。一般來(lái)說(shuō), 有兩類方法用于從SAXS波譜數(shù)據(jù)中提取淀粉結(jié)構(gòu)信息參數(shù)。一類方法基于直接觀察到的強(qiáng)度分布的最小二乘法擬合, 而另一類基于傅里葉變換的強(qiáng)度分布的相關(guān)函數(shù)和界面分布函數(shù)[9,17]。2種方法雖然可以全面分析獲取淀粉的結(jié)構(gòu)信息, 但都需要專業(yè)的數(shù)學(xué)和軟件編程專家參與, 制約了SAXS技術(shù)在淀粉結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用。在國(guó)內(nèi), 王維等[18]基于原子物理學(xué)原理設(shè)計(jì)了SAXS分析軟件(SAXS1.0), 可完成SAXS數(shù)據(jù)的Guinier作圖、Porod作圖以及分形維數(shù)的分析。雖然該軟件可以用于分析淀粉SAXS數(shù)據(jù)獲取結(jié)構(gòu)信息, 但是由于軟件本身缺乏穩(wěn)定性, 操作步驟復(fù)雜, 擬合誤差大等諸多原因, 在國(guó)內(nèi)仍未得到廣泛的應(yīng)用。基于上述原因, 我們建立了一種作圖分析方法, 可以定量測(cè)定SAXS波譜的峰強(qiáng)度、峰位置、半峰寬度和片層距離。與國(guó)內(nèi)外的其他方法相比, 該方法具有操作簡(jiǎn)單, 重復(fù)性好, 可信度高等諸多優(yōu)點(diǎn), 可以廣泛應(yīng)用于原淀粉、水解淀粉和糊化淀粉等的片層結(jié)構(gòu)研究中。

支鏈淀粉的側(cè)鏈形成晶體片層, 一般認(rèn)為, 短的側(cè)鏈易形成A-型晶體, 而長(zhǎng)的側(cè)鏈易形成B-型晶體[16]。A-型淀粉僅含有A-型晶體, B-型淀粉僅含有B-型晶體, 而C-型淀粉目前認(rèn)為包含A-和B-型晶體[16]。本文對(duì)不同植物來(lái)源的A-型淀粉(水稻和玉米淀粉)、B-型淀粉(馬鈴薯與土茯苓淀粉)、C-型淀粉(蓮藕和山藥淀粉)的SAXS波譜分析發(fā)現(xiàn), 散射波譜峰的參數(shù)與淀粉晶體類型沒(méi)有顯著的相關(guān)性, 而與植物的來(lái)源可能有關(guān), 這與Jenkins等[19]結(jié)果相一致。Cai等[20]對(duì)豌豆、蠶豆、山藥、荸薺4種C-型淀粉研究表明, 它們的結(jié)構(gòu)特性與功能特性均存在明顯的差異。這些研究結(jié)果進(jìn)一步表明, 淀粉的片層結(jié)構(gòu)與晶體類型并不相關(guān), 而是取決于不同的植物來(lái)源。Lin等[21]將蓮藕淀粉按大小分為不同的顆粒級(jí)分, SAXS波譜分析表明, 淀粉半晶體片層厚度與顆粒大小無(wú)相關(guān)性, 而散射峰強(qiáng)度與顆粒大小呈顯著的負(fù)相關(guān)。Salman等[22]對(duì)小麥淀粉的研究卻表明, 大淀粉粒的半晶體片層厚度大于小淀粉粒的半晶體片層厚度, 散射峰強(qiáng)度也表現(xiàn)一定的差異。因此, 不同植物來(lái)源的淀粉, 其大小、形態(tài)、分子結(jié)構(gòu)和晶體特性都有明顯差異[23], 這些差異可能共同導(dǎo)致它們具有不同的片層結(jié)構(gòu)。

本文利用作圖分析法對(duì)不同直鏈淀粉含量的普通水稻淀粉的SAXS波譜分析表明, 散射峰的峰強(qiáng)度與直鏈淀粉含量呈顯著的負(fù)相關(guān), 這與Bocharnikova等[24]和Koroteeva等[25]結(jié)果相一致。淀粉半晶體片層由無(wú)定形片層和晶體片層交替排列形成, 前者主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉的分支點(diǎn)組成, 后者由支鏈淀粉的側(cè)鏈組成[8-9]。SAXS波譜的峰強(qiáng)度反映淀粉晶體和非晶體區(qū)域之間的電子密度差異[8]。直鏈淀粉含量增加, 導(dǎo)致淀粉晶體和非晶體區(qū)域之間的電子密度降低, 表現(xiàn)在SAXS波譜峰強(qiáng)度降低, 其影響因素可能是: 直鏈淀粉大分子與支鏈淀粉A鏈形成共結(jié)晶, 直鏈淀粉在無(wú)定形片層中的含量增加, 以及直鏈淀粉在晶體和無(wú)定形片層內(nèi)部沿著片層層疊方向積累[8]。本文結(jié)果表明, 酸水解不影響淀粉片層距離; 但在酸水解的早期階段, 淀粉SAXS波譜峰的峰強(qiáng)度逐漸增高, 而在酸水解后期階段, 峰強(qiáng)度逐漸降低直至散射峰消失, 該結(jié)果與Wang等[26]研究相一致。Wang等[26]對(duì)豌豆淀粉進(jìn)行酸水解研究揭示, 在水解的初始階段非晶區(qū)更快的降解提高淀粉的相對(duì)結(jié)晶度, 這與散射峰強(qiáng)度顯著增加保持一致; 隨著非結(jié)晶區(qū)降解完成, 結(jié)晶和無(wú)定形區(qū)域的水解速率幾乎相同, 從而造成相對(duì)結(jié)晶度緩慢增加, 這與散射峰強(qiáng)度緩慢增加保持一致。因此, 在酸水解的早期階段, 酸優(yōu)先降解無(wú)定形片層, 導(dǎo)致晶體片層和無(wú)定形片層之間的電子密度增加, 引起峰強(qiáng)度的增加; 而在酸水解的后期, 酸主要水解晶體片層, 晶體片層的降解導(dǎo)致峰強(qiáng)度降低; 當(dāng)晶體片層完全被酸降解后, 淀粉散射波譜的散射峰消失[9,26]。本文結(jié)果還表明, 隨著糊化溫度的升高, 散射峰的峰強(qiáng)度逐漸降低直至消失, 這與Cameron等[5]結(jié)果相一致。淀粉糊化過(guò)程中, 隨著溫度的升高, 淀粉結(jié)晶區(qū)域被破壞, 晶體和無(wú)定形片層之間的電子密度降低; 當(dāng)加熱溫度達(dá)到微晶熔融溫度時(shí), 晶體和無(wú)定形片層有序排列結(jié)構(gòu)喪失, 導(dǎo)致糊化淀粉的散射峰消失[27]。

4 結(jié)論

淀粉SAXS波譜的作圖分析法能夠定量測(cè)定散射峰的峰強(qiáng)度、峰位置、半峰寬度和片層距離, 獲得淀粉片層結(jié)構(gòu)信息。利用該方法測(cè)定和比較分析不同晶體類型淀粉、不同直鏈淀粉含量的水稻淀粉、酸水解淀粉和糊化淀粉的SAXS波譜參數(shù), 具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、可信度高等優(yōu)點(diǎn), 可以廣泛應(yīng)用于作物淀粉片層結(jié)構(gòu)的研究。

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Application of Quantitative Graphical Method Based on Small Angle X-Ray Scattering Spectrum in Crop Starch Study

HE Wei1, FAN Xiao-Xu1, WANG Zhi-Feng2, and WEI Cun-Xu1,*

1Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology / Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;2Testing Center, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China

Small-angle X-ray scattering (SAXS) spectrum can be used to quantify the lamellar structure of starch. However, the spectrum analysis lacks a special data analysis software and needs complicated mathematical equations for it, which seriously restricts the applications of SAXS technology in starch studies. In this study, a simple graphical method was established to quantitatively measure the SAXS spectrum parameters (peak intensity, peak position, peak width at half maximum, and lamellar distance). These parameters can reflect the information of starch lamellar structure. The SAXS spectra of starch with different crystal types, rice starch with different amylose contents, and acid-modified and gelatinized starch were all analyzed using the graphical method, showing that the lamellar structure of starch was related with the plant origin, but had no direct relationship with crystal types. For the starch from the same plant origin, the amylose content was significantly negatively correlated with peak intensity and peak width at half maximum, and positively correlated with lamellar distance of SAXS spectrum. The acid hydrolysis had no effect on lamellar distance of starch, but changed the peak intensity and peak width at half maximum of SAXS spectrum. Heating treatment also had no effect on lamellar distance of starch, but destroyed the crystalline structure, leading to the gradual decrease, even disappearance of peak intensity with increasing heating temperature. This study indicated that the quantitative graphical method is simple, good repeatable, and highly credible, and could be widely used in crop starch studies.

Crop starch; Small-angle X-ray scattering spectrum; Spectrum parameter; Quantitative graphical method; Lamellar structure

10.3724/SP.J.1006.2017.01827

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31570324)和江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31570324) and the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

韋存虛, E-mail: cxwei@yzu.edu.cn, Tel: 0514-87997217

E-mail: 1349765922@qq.com, Tel: 15380375313

2017-01-09; Accepted(接受日期): 2017-09-10; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-09-28.

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170928.1458.002.html