DDNNAA條形碼技術(shù)及其在動(dòng)物物證鑒定中的應(yīng)用

馬艷君 周用武 黃婭琳

野生動(dòng)植物是地球自然資源的重要組成部分，具有很高的生態(tài)意義，并包括了科學(xué)、文化、經(jīng)濟(jì)在內(nèi)的多方面價(jià)值。然而，隨著人類(lèi)文明的不斷發(fā)展和社會(huì)的進(jìn)步，野生動(dòng)物的棲息地已經(jīng)并仍在被人類(lèi)不斷侵蝕，加之動(dòng)植物資源過(guò)度消耗，全球動(dòng)植物資源總量下降較快。由于高額利益驅(qū)使，近年來(lái)，非法野生動(dòng)植物及其制品貿(mào)易犯罪鏈條已相當(dāng)完備，犯罪手法不斷變換，破壞野生動(dòng)物資源的違法犯罪活動(dòng)仍屢禁不止，野生動(dòng)植物及其制品的非法貿(mào)易已成為繼毒品、武器之后的世界第三大非法貿(mào)易。為了規(guī)范管理涉及動(dòng)植物的經(jīng)濟(jì)活動(dòng)，打擊違法犯罪行為，保護(hù)野生動(dòng)植物資源，在規(guī)范管理和保護(hù)執(zhí)法的過(guò)程中，必然要對(duì)涉及的動(dòng)植物進(jìn)行物種鑒定。

公安及相關(guān)部門(mén)偵辦動(dòng)物案件時(shí)，常會(huì)遇到部分犯罪嫌疑人為逃避檢查和法律制裁，對(duì)動(dòng)物尸體進(jìn)行剝皮、肢解、掩埋、蒸煮或焚燒、深加工等，這使得涉案動(dòng)物喪失了其宏觀形態(tài)學(xué)特征，常規(guī)形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)的方法不適用于這些上述檢材的鑒定。在這種情況下，就要利用微觀的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)相關(guān)檢材進(jìn)行鑒定。采用DNA條形碼（DNA Barcoding）技術(shù)鑒定動(dòng)物物種是近年來(lái)物種識(shí)別中最為熱門(mén)并發(fā)展最快的一項(xiàng)DNA分析技術(shù)，本文對(duì)DNA條形碼技術(shù)及其在打擊動(dòng)物犯罪中的動(dòng)物物證鑒定應(yīng)用進(jìn)行了概述。

一、DNA條形碼技術(shù)與形態(tài)學(xué)分類(lèi)技術(shù)的比較

2003年，Hebert等將分子方法拓展至生物物種分類(lèi)應(yīng)用中，正式提出DNA條形碼的概念。DNA條形碼技術(shù)是一種建立在DNA序列標(biāo)記技術(shù)及相關(guān)的系統(tǒng)發(fā)育和分類(lèi)研究基礎(chǔ)上的物種鑒定方法，所用的DNA片段具有物種內(nèi)特異性和物種間的多樣性，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)物種進(jìn)行鑒定，類(lèi)似于通過(guò)掃描商品條形碼識(shí)別具體商品種類(lèi)的過(guò)程。由于DNA條形碼技術(shù)快速和容易操作，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)的缺陷，有利于發(fā)現(xiàn)新物種，具有巨大的科學(xué)應(yīng)用潛力，在其他學(xué)科領(lǐng)域的研究中也得到了一定的應(yīng)用。

物種鑒定是一項(xiàng)很艱巨的任務(wù)。Mora C等的研究預(yù)測(cè)動(dòng)物種類(lèi)數(shù)將達(dá)到777萬(wàn)種，而已經(jīng)描述和分類(lèi)的生物有約953430種，更多的物種還有待人類(lèi)去發(fā)現(xiàn)和分類(lèi)；研究還表明，陸地上約有86%、海洋中約有91%的物種還沒(méi)有被人們發(fā)現(xiàn)和分類(lèi)。然而目前關(guān)于物種鑒定最常用的形態(tài)學(xué)分類(lèi)法卻存在著難以克服的缺陷：動(dòng)物的表型可塑性（Phenotypic plasticity）和遺傳可變性（Genetic variability）容易導(dǎo)致鑒定的錯(cuò)誤，且許多群體中普遍存在的隱存分類(lèi)單元也無(wú)法用常規(guī)形態(tài)分類(lèi)法進(jìn)行鑒定；生物性別和發(fā)育階段也會(huì)影響傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法，導(dǎo)致很多生物無(wú)法被準(zhǔn)確鑒定。此外，分類(lèi)學(xué)家的識(shí)別能力也有局限性。形態(tài)學(xué)鑒定的局限性和不斷縮減的分類(lèi)學(xué)家隊(duì)伍，使分類(lèi)學(xué)的發(fā)展面臨巨大的挑戰(zhàn)。

21世紀(jì)初分子生物學(xué)的巨大進(jìn)步以及海量生物分子遺傳信息的互聯(lián)網(wǎng)共享為上述問(wèn)題提供了一個(gè)解決方法。DNA條形碼技術(shù)在從病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物到脊椎動(dòng)物等高等生物的識(shí)別中均有極佳表現(xiàn)，可以很好地識(shí)別生物的多樣性。在高等生物識(shí)別中，通過(guò)分析動(dòng)物線粒體特定基因片斷序列就能鑒定該物種的技術(shù)，已經(jīng)在物種多樣性調(diào)查中得到了廣泛應(yīng)用，積累了大量的文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)。這促進(jìn)了以DNA序列作為生物物種鑒定平臺(tái)的發(fā)展。DNA條形碼技術(shù)可以快速識(shí)別物種的局部組織，鑒定不受物種發(fā)育階段以及個(gè)體形態(tài)特征的影響，不受物種的限制，并且有利于發(fā)現(xiàn)新種和隱存種。此外，該技術(shù)的準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)單易行，易于掌握和推廣。

二、用于動(dòng)物種屬鑒定的DNA條形碼基因

作為DNA條形碼的序列應(yīng)具備以下特征：一方面必須具有可區(qū)分物種的變異，同時(shí)要具有相對(duì)的保守性，種內(nèi)變異要盡量??；二是其兩端要同相對(duì)保守的引物連接，以便設(shè)計(jì)通用引物；三是目標(biāo)DNA片段應(yīng)相對(duì)較短，以便于DNA的提取和擴(kuò)增。

應(yīng)用于動(dòng)物界的DNA條形碼主要有線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）基因和核DNA（nuclear DNA，nDNA）基因。其中，mtDNA分子具備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、嚴(yán)格的母系遺傳、無(wú)重組、與核基因組無(wú)共同序列、進(jìn)化速率快、多拷貝及分子鐘理論等優(yōu)點(diǎn)，比nDNA更容易檢測(cè)，更容易受遺傳漂變的影響，并具有廣泛的種內(nèi)和種間多態(tài)性，親緣關(guān)系相關(guān)或相近的物種都能得到區(qū)分和鑒定。mtDNA分子標(biāo)記有很多，常被用作動(dòng)物種屬鑒定的mtDNA基因有：線粒體細(xì)胞色素氧化酶1基因（Cytochrom-Oxidase I，CO I）、細(xì)胞色素b基因（cytochrome b，cyt b）、12S核糖體核糖核酸基因（ribosomal RNA，rRNA）、16S核糖體核糖核酸基因基因、線粒體DNA控制區(qū)（Displacement Loop Region，D-loop）、線粒體NADH脫氫酶基因（NADH Dehydrogenase，ND）等。此外，簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeats，SSR）或短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）基因座、單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）等核基因也被用于物種鑒定，并常用于動(dòng)物個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。

由于DNA檢材的狀況、基因組變異率、目的DNA片段的長(zhǎng)度和完整性等都會(huì)影響到檢材PCR擴(kuò)增的結(jié)果，因此，在對(duì)不同檢材進(jìn)行DNA鑒定時(shí)，可依據(jù)檢材的狀況來(lái)選擇合適的目的基因。例如，野生動(dòng)物類(lèi)案件中的涉案生物檢材常為各種體液和組織，又經(jīng)常處于陰暗潮濕、高溫或是日照強(qiáng)烈的露天環(huán)境，也?；祀s污染物，很容易發(fā)生變質(zhì)、降解、腐敗，DNA容易斷裂。對(duì)于這類(lèi)的檢材，應(yīng)選取小片段目的基因作為DNA條形碼。由于在對(duì)目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并比對(duì)時(shí)，物種信息依賴于GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)中的關(guān)于該物種的信息量和準(zhǔn)確性，因此，在選擇目的基因時(shí)，應(yīng)盡量選擇生物信息豐富的基因。例如，cyt b基因擁有合適的進(jìn)化速率和長(zhǎng)度，是目前為止Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中線粒體基因研究數(shù)據(jù)最多并且在脊椎動(dòng)物中被測(cè)序得最廣泛的基因，能充分滿足物種鑒定的要求，適合用于物種的DNA鑒定。此外，還應(yīng)選擇合適的DNA提取方法，以保證獲得質(zhì)量較好的DNA。

三、DNA條形碼技術(shù)在動(dòng)物物證鑒定中的應(yīng)用

我國(guó)素有食用、藥用、衣用、飼養(yǎng)和觀賞野生動(dòng)物或其制品的傳統(tǒng)。改革開(kāi)放以來(lái)我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)快速發(fā)展，各方面對(duì)野生動(dòng)物的需求十分巨大，合法來(lái)源產(chǎn)品難以滿足需求。這促使了在一段時(shí)期內(nèi)，非法狩獵或殺害珍貴野生動(dòng)物以及非法收購(gòu)、運(yùn)輸、出售走私珍貴野生動(dòng)物或其制品等犯罪活動(dòng)愈演愈烈，使得生物多樣性和生態(tài)平衡遭到破壞和威脅，并可能導(dǎo)致偷漏稅費(fèi)和疫病傳播等嚴(yán)重后果，危及國(guó)人健康，甚至影響中醫(yī)藥的可持續(xù)發(fā)展，使國(guó)家和民族形象受損。DNA條形碼技術(shù)是物種鑒定的有力工具，在打擊動(dòng)植物犯罪中也起到了重要的作用。以筆者所在鑒定中心為例，近年來(lái)，DNA鑒定在動(dòng)物物種鑒定中所占比例呈明顯上升趨勢(shì)，DNA條形碼技術(shù)可用于野生動(dòng)物保護(hù)、中藥資源保護(hù)、食品安全監(jiān)測(cè)、動(dòng)物親子鑒定和個(gè)體識(shí)別、澄清案件性質(zhì)等多個(gè)方面。

（一）動(dòng)物種屬和種群鑒別

mtDNA在動(dòng)物種屬鑒定方面有著很好的應(yīng)用。例如，我國(guó)新疆地區(qū)分布有北山羊、高鼻羚羊、盤(pán)羊、巖羊、黃羊、鵝喉羚、馬鹿、駝鹿、狍等多種國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，同時(shí)牧民也有飼養(yǎng)家山羊、綿羊等牲畜。各種“羊”“羚”“鹿”在被去除了角、頭、蹄等特征性部位，并被剝皮、肢解后，很難區(qū)分。如果不能對(duì)涉案樣本進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，會(huì)對(duì)案件的性質(zhì)和案件偵破的方向造成重要影響。北山羊和家山羊同屬偶蹄目?？粕窖?qū)傥锓N，親緣關(guān)系較近。筆者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)，利用cyt b基因就可以很好的區(qū)分北山羊和家山羊這兩個(gè)不同物種。

2017年1月1日新修訂的《中華人民共和國(guó)野生動(dòng)物保護(hù)法》第二十八條規(guī)定了“對(duì)人工繁育技術(shù)成熟穩(wěn)定的國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物的人工種群不再列入國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物保護(hù)名錄，實(shí)行與野外種群不同的管理措施”的管理辦法；在2017年7月1日公布實(shí)施的第一批《人工繁育國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)陸生野生動(dòng)物名錄》中，就包括了梅花鹿、馬鹿等國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。正確區(qū)分國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物的人工種群和野外種群，是查明野生動(dòng)物產(chǎn)品來(lái)源、界定案件性質(zhì)、防止非法來(lái)源的野生動(dòng)物產(chǎn)品流入合法渠道的重要環(huán)節(jié)之一。研究表明，mtDNA的D-loop區(qū)有著較高的進(jìn)化速率，能較好地區(qū)分動(dòng)物亞種和不同來(lái)源的種群，為動(dòng)物種群鑒定提供可靠的依據(jù)。

（二）動(dòng)物制品種屬來(lái)源鑒定

以往各海關(guān)口岸對(duì)犀牛角、羚羊角等角制品的動(dòng)物種屬來(lái)源鑒定主要依賴于形態(tài)學(xué)方法，在某些情況下經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的技術(shù)人員使用關(guān)鍵的形態(tài)學(xué)特征就能進(jìn)行常規(guī)鑒定工作，但大多數(shù)情況需要經(jīng)驗(yàn)豐富的分類(lèi)專家，如果樣本經(jīng)過(guò)人為加工、改造，使原動(dòng)物制品失去了其關(guān)鍵形態(tài)特征，就會(huì)使分類(lèi)專家很難對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。此外，形態(tài)鑒別特征常有的趨同和變異會(huì)導(dǎo)致物種間的鑒定誤差。DNA條形碼技術(shù)一定程度上能夠解決這個(gè)問(wèn)題。由于特定的物種具有特定的DNA短片段序列信息，實(shí)際工作中，即使所需檢定的動(dòng)物制品形式多種多樣、經(jīng)過(guò)加工后的制成品與原來(lái)的形態(tài)有很大差別，絕大多數(shù)情況下DNA條形碼技術(shù)也能很好地實(shí)現(xiàn)對(duì)不同形式的動(dòng)物制品的鑒定。由于DNA技術(shù)是可機(jī)械重復(fù)的，通過(guò)一套簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)技術(shù)，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單培訓(xùn)的技術(shù)員即可操作。這樣的工作可投放到基層單位，且準(zhǔn)確性高。

（三）混合肉制品鑒定

肉制品中動(dòng)物源性成分的鑒定對(duì)野生動(dòng)物保護(hù)、打擊食品摻假造假、保障消費(fèi)者知情權(quán)均具有重要作用。由于食品中肉類(lèi)經(jīng)過(guò)加工過(guò)程后，常會(huì)改變?cè)械男螒B(tài)學(xué)特征、質(zhì)地、氣味等，這增加了品種鑒定的困難。利用mtDNA特異性引物，能夠分析動(dòng)物種類(lèi)；結(jié)合復(fù)合PCR技術(shù)，用多對(duì)引物同時(shí)對(duì)多個(gè)基因目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)對(duì)肉制品中混合動(dòng)物源性成分的區(qū)別和鑒定，準(zhǔn)確高效，便于推廣。

（四）動(dòng)物個(gè)體識(shí)別與親權(quán)鑒定

在我國(guó)走私、非法獵捕、殺害、收購(gòu)、運(yùn)輸、出售珍貴瀕危陸生野生動(dòng)物重大案件、特別重大案件立案標(biāo)準(zhǔn)中，都涉及對(duì)保護(hù)動(dòng)物數(shù)量的確定，而在涉及已肢解動(dòng)物、動(dòng)物制品的案件中，就很難通過(guò)常規(guī)的形態(tài)以及痕跡特征確定具體動(dòng)物數(shù)量，這就對(duì)相關(guān)案件的立案、判決及后繼處理造成很大影響。STR和SNP在動(dòng)物個(gè)體識(shí)別與親權(quán)鑒定方面的應(yīng)用，就能很好地解決上述問(wèn)題。

DNA條形碼技術(shù)將使執(zhí)法、科研、檢疫檢驗(yàn)工作更加高效，使過(guò)去專家才能掌握的知識(shí)更好地服務(wù)于大眾與社會(huì)。DNA條形碼技術(shù)能夠準(zhǔn)確、快速地實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物源性成分的鑒定，為動(dòng)物鑒定提供一種快速、靈敏的新方法，對(duì)相關(guān)監(jiān)管部門(mén)、各檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對(duì)動(dòng)物及其制品進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)研究提供了方法指導(dǎo)和技術(shù)支持，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的缺陷，并為食品安全、野生動(dòng)物保護(hù)和商品貿(mào)易提供有力的幫助，同時(shí)對(duì)保障廣大人民群眾的身體健康和生活質(zhì)量，維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展都具有積極作用。此外，DNA條形碼技術(shù)在植物鑒定中也有很好的應(yīng)用。總之，DNA條形碼技術(shù)有利于提高涉及動(dòng)植物的案件中動(dòng)植物物種鑒定的檢出率和準(zhǔn)確性，揭示生物檢材與案件的內(nèi)在聯(lián)系，為公安及相關(guān)部門(mén)執(zhí)法辦案提供極大的便利，也為依法打擊相關(guān)違法行為提供有力的技術(shù)支持，具有廣闊的應(yīng)用前景。