斑馬魚在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究

祁美娟，石美智，韓永龍

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2. 上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院東院藥劑科，上海 201306)

斑馬魚(Zebrafish, Danio rerio)是輻鰭亞綱鯉科短擔(dān)尼屬的熱帶觀賞性淡水魚。斑馬魚最早被用于水體污染，致畸和有毒物質(zhì)的檢測[1]。1981年，美國生物學(xué)家Streisinger等[2]首次在Nature上發(fā)表了關(guān)于斑馬魚的文章，介紹了斑馬魚是將遺傳學(xué)、胚胎學(xué)和分子生物學(xué)有機(jī)結(jié)合的一種理想模式動物，此后斑馬魚被廣泛用于科學(xué)研究中。

斑馬魚相比哺乳動物是體外受精，且胚胎透明，可觀察到內(nèi)部的組織器官。成年斑馬魚體長4～5 cm，胚胎可置96孔板中培養(yǎng)，培育成本較低。斑馬魚繁殖周期短、產(chǎn)卵數(shù)量多，可用于大規(guī)模藥物篩選。斑馬魚給藥方式簡單，直接將藥物溶于水中，魚可通過皮膚、鰓、消化系統(tǒng)等來吸收，相比傳統(tǒng)給藥方式操作簡單，節(jié)約試劑?？茖W(xué)家Howe等[3]研究了斑馬魚的基因組序列，發(fā)現(xiàn)斑馬魚與人的相似基因可達(dá)87%。當(dāng)把引起人類疾病的基因注射到斑馬魚胚胎中時，斑馬魚最終獲得了同樣的疾病，所以斑馬魚被廣泛用于遺傳疾病(如抑郁癥)、精神分裂癥和帕金森病的研究。研究表明，斑馬魚與人類一樣可表達(dá)多種藥物代謝酶，如I相代謝酶細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)及II相代謝酶尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glycosyltransferases,UGT)和磺基轉(zhuǎn)移酶 (Sulfotransferase,SULT)等[4]。隨著科學(xué)實(shí)驗(yàn)的發(fā)展，斑馬魚在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用越來越多。由于斑馬魚自身的一些優(yōu)點(diǎn)，使其在藥學(xué)領(lǐng)域的作用越來越重要。本文查閱了近年來國內(nèi)外斑馬魚在藥學(xué)領(lǐng)域研究的文獻(xiàn)，對其研究進(jìn)行歸納、整理，為以后斑馬魚在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供新思路。

1 藥物代謝的研究

1.1斑馬魚的藥物代謝酶CYP450是單加氧酶超家族，其中CYP1、2、3家族是異種生物轉(zhuǎn)化和活化的關(guān)鍵酶。在人體中有5個CYP酶亞型，即CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4/5，占肝臟中CYP含量的65%，這些酶可負(fù)責(zé)大約70%的臨床藥物氧化[5]。研究表明，斑馬魚同人類一樣可表達(dá)I相代謝酶(CYP450)和II相代謝酶(UGT、SULT)。Stegeman等[6]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚有94個CYP基因，根據(jù)氨基酸序列的同一性可分為18個基因家族，這和人類及其他哺乳動物一樣。CYP基因中5-51家族有32個基因，且和人類的CYP基因?qū)僦毕低?，這些基因序列的高度相似提示人和斑馬魚酶活性的一致性。Huang等[7]通過識別和克隆完整的斑馬魚UGT基因庫發(fā)現(xiàn)，斑馬魚基因組包含45個UGT基因，可分為3個家族：UGT1、UGT2、UGT5。UGT1 和 UGT2都被分成兩個基因簇：a和b。UGT1a、UGT1b、UGT2a、UGT2b基因簇都包含了可變區(qū)域和不變區(qū)域。UGT5基因是一類新穎的UGT基因家族，只存在于硬骨魚和兩棲類中。

斑馬魚作為藥物代謝的模型，主要是由于斑馬魚的基因與人類基因具有相似性。人和斑馬魚的CYP1和CYP3家族中有部分基因是直系同源，斑馬魚CYP1A和人CYP1A1、CYP1A2有相似的外顯子結(jié)構(gòu)，斑馬魚的CYP1B1和人的CYP1B1也非常相似。但是，異生代謝酶CYP 1-4家族中，斑馬魚有47個CYP2基因，而人類只有18個[8]。斑馬魚的CYP5A1與人的CYP5A1基因保持48%的序列同一性，這說明斑馬魚與人共享CYP5A的合成區(qū)域。斑馬魚CYP3A65基因是人CYP3A4同源物，在斑馬魚肝臟中表達(dá)量占54%，斑馬魚CYP3A65與人CYP3A4相似可被異種生物地塞米松和利福平誘導(dǎo)[9]。

1.2斑馬魚藥物代謝的研究Alderton等[10]在常規(guī)的藥理和毒理實(shí)驗(yàn)中，分析常用的人CYP酶探針底物在斑馬魚幼體中的代謝情況，發(fā)現(xiàn)他克林(CYP1A2)、雙氯芬酸 (CYP2C9)、安非他酮(CYP2B6)、睪酮(CYP3A4)在受精7d后的斑馬魚幼體中發(fā)生羥化反應(yīng)。對化合物西沙必利、氯丙嗪、維拉帕米、睪酮和右美沙芬代謝物的分析發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚幼體中能催化發(fā)生Ⅰ相代謝反應(yīng)(氧化、N-脫甲基、O-脫乙基和N-脫烷基)和Ⅱ相代謝反應(yīng)(硫酸化和葡萄糖醛酸化)。非那西丁(CYP1A2)和右美沙芬(CYP2D6)分別能被代謝為撲熱息痛和右啡烷，這與人體的代謝產(chǎn)物一致[11]。7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ECOD)能將7-乙氧基香豆素代謝為7-羥基香豆素，表明斑馬魚有CYP2酶活性；斑馬魚辛基甲氧基試鹵靈(OOMR)代謝為試鹵靈，顯示其有CYP3酶活性。斑馬魚原代肝細(xì)胞能將睪酮代謝為6β-羥基睪酮，說明斑馬魚能發(fā)生人CYP3A4的特征反應(yīng)[12]。

2 中藥的研究

斑馬魚在中藥中的應(yīng)用研究也比較普遍。陳侃等[13]利用斑馬魚研究7種中藥單體的降脂作用。通過高脂飲食構(gòu)建斑馬魚高脂血癥模型，使用油紅O染色，研究7種中藥單體對斑馬魚血脂的影響，通過檢測斑馬魚血清總膽固醇、甘油三酯驗(yàn)證藥物的降脂作用，并初步探討藥物降脂的可能機(jī)制。結(jié)果顯示，高脂飲食后斑馬魚幼魚血脂升高，經(jīng)7種中藥單體處理后，油紅O染色顯示大黃酚能降低斑馬魚幼魚血脂。高脂飲食的成年斑馬魚經(jīng)大黃酚藥浴8周后血清總膽固醇、甘油三酯水平均下降。大黃酚增加斑馬魚腸蠕動的頻率，加速腸道排空。結(jié)果表明，大黃酚可降低高脂飲食后斑馬魚的血脂水平，其機(jī)制可能是大黃酚加快了高脂食物從腸道排出，減少了腸道對脂質(zhì)的吸收。

當(dāng)歸是一種婦科疾病常見治療藥物，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛等功效。Zhong 等[14]利用斑馬魚模型研究當(dāng)歸提取物對血管新生的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸提取物可以誘導(dǎo)斑馬魚胚胎腸下靜脈的新生血管的變化。Zhao等[15]利用斑馬魚的血管損傷模型發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸提取物SBD-4能復(fù)原斑馬魚的血管，說明當(dāng)歸提取物可以作為一種治療血管新生不足類疾病的潛在藥物。

Liu等[16]采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎血管生成模型，通過對地黃水提取物的不同萃取部位進(jìn)行了活性篩選，并對其活性部位主要化學(xué)成分進(jìn)行了血管藥效學(xué)研究。研究表明，地黃水粗提取物可增加斑馬魚腸下靜脈毛細(xì)血管形成數(shù)量，且有促進(jìn)血管生成的作用。

3 藥物毒理學(xué)的研究與安全性評價

斑馬魚最早被用于水體污染、致畸和有毒物質(zhì)的檢測，現(xiàn)已成為一種有效評估藥物毒性和安全性的動物模型。斑馬魚作為藥物毒理學(xué)模型，具有實(shí)驗(yàn)用藥量少、費(fèi)用低、實(shí)驗(yàn)周期短、高通量等特點(diǎn)，又具有可觀察的器官，可以進(jìn)行藥效學(xué)、藥動學(xué)、評價代謝物活性等實(shí)驗(yàn)研究。目前，斑馬魚模型已被用于水體檢測、心血管毒性、肝毒性、腎毒性、行為學(xué)毒性等應(yīng)用研究。

李春杰等[17]建立細(xì)胞色素P450 CYP3A65熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，用于檢測污水中常含有的重金屬( 銅、鎘、鋅) 及類二噁英化合物五氯聯(lián)苯( PCB126) 等環(huán)境污染物。結(jié)果顯示，綠色熒光在此轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的肝和消化道中表達(dá)；該轉(zhuǎn)基因斑馬魚對3種重金屬及PCB126產(chǎn)生響應(yīng)，使此模型應(yīng)用在環(huán)境污染物的檢測上成為可能。

此外，斑馬魚也被用于評價農(nóng)藥的安全性，如用斑馬魚研究有機(jī)氯農(nóng)藥(艾氏劑、林丹、毒殺酚等)、有機(jī)磷農(nóng)藥(甲胺磷、毒死蜱、殺蟲畏等)、殺菌劑(福美雙、多菌靈、代森鋅等)的毒性，評價這些農(nóng)藥的安全性及其對環(huán)境的影響[18]。

4 藥物篩選與新藥發(fā)現(xiàn)

斑馬魚為良好的脊椎動物模式生物，隨著研究的深入，斑馬魚在疾病模型和藥物篩選領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。近年來，科學(xué)家利用斑馬魚探索出新的疾病模型和篩選技術(shù)，找到了一些活性化合物，并且這些化合物在哺乳動物中也有相似效果，如前列腺素E2和來氟米特已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，分別用來促進(jìn)臍帶血細(xì)胞移植后的增殖和治療黑素瘤。這表明斑馬魚模型很適合用于藥物篩選[19]。

張紅翠等[20]采用MTT法檢測順鉑、紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶4種藥物對HL-60和Hela細(xì)胞的增殖影響，并觀察藥物對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，阿霉素、順鉑及紫杉醇作用于HL-60及Hela細(xì)胞的IC50均明顯高于作用于斑馬魚胚胎的LD50，而5-氟尿嘧啶作用于腫瘤細(xì)胞和斑馬魚胚胎的結(jié)果與其它藥物相反，4種抗腫瘤藥物對斑馬魚胚胎的生長發(fā)育均有致畸作用。

帕金森病是老年人群中常見的神經(jīng)退行性疾病之一，患者運(yùn)動失調(diào)，身體僵硬震顫。帕金森病的病理特點(diǎn)是多巴胺能神經(jīng)元減少和大腦出現(xiàn)路易氏小體。臨床上常用左旋多巴和芐甲炔胺來治療帕金森病，但不能根治。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的神經(jīng)系統(tǒng)跟人相似，將胚胎用神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶 (MPTP)處理后，出現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量減少和運(yùn)動遲緩等癥狀，這種癥狀可被芐甲炔胺緩解，而且，MPTP和芐甲炔胺的作用機(jī)制在人和斑馬魚間是保守的，都要通過單胺氧化酶來起作用[21]。斑馬魚的胚胎沒有血腦屏障，有利于藥物進(jìn)入腦。斑馬魚是很好的帕金森病模型。

5 再生藥物的研究

現(xiàn)已有文獻(xiàn)證明，斑馬魚的壽命在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)可能會超過5年[22]。斑馬魚已迅速發(fā)展為細(xì)胞和生物發(fā)育的橋梁。斑馬魚受精10 h后原腸胚就發(fā)育完成，所以有學(xué)者推測斑馬魚可成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)關(guān)于研究細(xì)胞和亞細(xì)胞的模型。斑馬魚的鰭、心臟、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、脊髓、肝臟及感覺毛細(xì)胞等都具有很強(qiáng)的再生能力，所以其在心臟、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、鰭再生醫(yī)學(xué)中都有進(jìn)一步的研究[23]。

6 結(jié)語

動物實(shí)驗(yàn)在科學(xué)研究中起著重要作用，雖然細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)被廣泛應(yīng)用，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)預(yù)測結(jié)果有一定差距。以哺乳動物為例，其飼養(yǎng)成本高、實(shí)驗(yàn)周期長，因此，尋求新的實(shí)驗(yàn)動物模型很有必要，其中包括無脊椎動物和魚。生物醫(yī)學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚基因和代謝酶接近人類，體外胚胎發(fā)育快速，生理復(fù)雜，器官容易觀察，模型空間小，成本低，這些使得斑馬魚成為一個非常重要的動物模型。隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖密度過大、飼料設(shè)計欠合理、投喂頻率過高等因素，廣泛引起魚類出現(xiàn)脂肪肝。脂肪肝致使魚類游動緩慢、食欲降低，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖魚類生長及抗病能力，誘發(fā)養(yǎng)殖魚類病害，對水產(chǎn)養(yǎng)殖造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，所以解決斑馬魚的飼養(yǎng)問題，可以預(yù)見斑馬魚將在藥學(xué)領(lǐng)域乃至醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)l(fā)揮巨大作用。

[1] Laale H W. The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research [J].JFishBiol，1977，10(2)：121-73.

[2] Streisinger G，Walker C，Dower N，et al. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio) [J].Nature，1981，291(5813)：293-6.

[3] Howe K，Clark M D，Torroja C F，et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome[J].Nature，2013，496(7446)：498-503.

[4] 寧 青，韋英杰，王丹丹，等. 斑馬魚藥物代謝模型的適用性研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2016，8(46)：1231-6.

[4] Ning Q，Wei Y J，Wang D D，et al. Advances in study on applicability of drug metabolism model in zebrafish[J].ChinTraditHerbDrugs，2016，8(46)：1231-6.

[5] Zanger U M，Schwab M. Cytochrome P450 enzymes in drug metabolism: regulation of gene expression, enzyme activities, and impact of genetic variation [J].PharmacolTher，2013，138(1)：103-41.

[6] Stegeman J J，Behrendt L，Woodin B R，et al. Functional characterization of zebrafish cytochrome P450 1 family proteins expressed in yeast [J].BiochimBiophysActa，2015，1850(11)：2340-52.

[7] Huang H，Wu Q. Cloning and comparative analyses of the zebrafish Ugt repertoire reveal its evolutionary diversity[J].PLoSOne，2010，5(2)：e9144.

[8] Goldstone J V，McArthur A G，Kubota A，et al. Identification and developmental expression of the full complement of cytochrome P450 genes in zebrafish [J].BMCGenomics，2010，11(1)：643-64.

[9] Chang C T，Chung H Y，Su H T，et al. Regulation of zebrafish CYP3A65 transcription by AHR2[J].ToxicolApplPharmacol，2013，270(2)：174-84.

[10] Alderton W，Berghmans S，Butler P，et al. Accumulation and metabolism of drugs and CYP probe substrates in zebrafish larvae [J].Xenobiotica，2010，40(8)：547-57.

[11] Reschly E J，Bainy A C，Mattos J J，et al. Functional evolution of the vitamin D and pregnane X receptors [J].BMCEvolBiol，2007，7(1)：1-17.

[12] Li Z H，Alex D，Siu SO，et al. Combinedinvivoimaging and omics approaches reveal metabolism of icaritin and its glycosides in zebrafish larvae[J].MolBiosyst，2011，7(7)：2128-38.

[13] 陳 侃，王長謙，范虞琪，等. 斑馬魚平臺研究七種中藥單體的降脂作用[J]. 生理學(xué)報，2017，69(1)：55-60.

[13] Chen K，Wang C Q， Fan Y Q，et al. Lipid-lowering effect of seven traditional Chinese medicine monomers in zebrafish system[J].ActaPhysiolSin，2017，69(1)：55-60.

[14] Zhong Z F，Hoi P M，Wu G S，et al. Anti-angiogenic effect of furanodiene on HUVECs in vitro and on zebrafishinvivo[J].JEthnopharmacol，2012，141(2)：721-7.

[15] Zhao H， Deneau J， Che G O，et al. Angelica sinensis isolate SBD.4: composition, gene expression profiling, mechanism of action and effect on wounds, in rats and humans[J].EurJDermatol，2012，22(1)：58-67.

[16] Liu C L， Cheng L，Kwok H F，et al. Bioassay-guided isolation of norviburtinal from the root of Rehmannia glutinosa, exhibited angiogenesis effect in zebrafish embryo model[J].JEthnopharmacol，2011，137(3)：1323-7.

[17] 李春杰，趙 建，張世勇，等. 細(xì)胞色素P450 CYP3A65斑馬魚模型建立及對環(huán)境污染物的生物響應(yīng)[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2014，28(6)：870-7.

[17] Li C J，Zhao J，Zhang S Y，et al. Establishment of a cytochrome P450 CYP3A65 zebrafish model and its biological response to environmental pollutants[J].ChinJPharmacolToxicol，2014，28(6)：870-7.

[18] Yu L，Chen M，Liu Y，et al. Thyroid endocrine disruption in zebrafish larvae following exposure to hexaconazole and tebuconazole [J].AquatToxicol，2013，138(139)：35-42.

[19] 辛勝昌，趙艷秋，李 松，等. 斑馬魚模型在藥物篩選中的應(yīng)用[J]. 遺傳，2012，34(9)：1144-52.

[19] Xin S C， Zhao Y Q， Li S，et al. Application of zebrafish models in drug screening [J].Hereditas，2012，34(9)：1144-52.

[20] 張紅翠，王曉偉，徐曉敏，等. 斑馬魚胚胎和腫瘤細(xì)胞評價細(xì)胞毒藥物活性比較研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12(27)：5214-7+87.

[20] Zhang H C，Wang X W，Xu X M，et al. Evaluation cytotoxic drugs activities with zebrafish embryos and tumor cells[J].ProgModBiomed, 2012，12(27)：5214-7+87

[21] McKinley E T，Baranowski T C，Blavo D O，et al. Neuroprotection of MPTP-induced toxicity in zebrafish dopaminergic neurons[J].BrainResMolBrainRes，2005，141(2)：128-37.

[22] Gerhard G S，Kauffman E J，Wang X，et al. Life spans and senescent phenotypes in two strains of zebrafish (Danio rerio)[J].ExpGerontol，2002，37(8-9)：1055-68.

[23] 嚴(yán)麗鋒，顧愛華. 斑馬魚在再生醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用及進(jìn)展[J]. 遺傳，2013，35(7)：856-66.

[23] Yan L F，Gu A H. Progress and application of zebrafish in regenerative medicine[J].Hereditas，2013，35(7)：856-66.