環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微流控檢測(cè)方法研究進(jìn)展

殷宏 湯小玉 薛強(qiáng) 鄒明強(qiáng)

（中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院裝備技術(shù)研究所 北京 100123）

1 前言

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) （Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是2000年由日本榮研株式會(huì)社的Notomi等人提出的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)[1]。它依賴于4～6條特異性引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶），在等溫條件（60～65℃）下可高效、快速、特異性地?cái)U(kuò)增靶序列[1-2]。該技術(shù)避免了傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增方法對(duì)溫度以及對(duì)精密儀器的依賴性，具有快速、高效、靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的典型代表。

微全分析系統(tǒng)（Miniaturized Total Analysis Systems，TAS）或稱芯片實(shí)驗(yàn)室（Laboratory-on-a-Chip，簡(jiǎn)稱LOC）是跨學(xué)科的新領(lǐng)域，目標(biāo)是通過(guò)分析化學(xué)、微機(jī)電加工（MEMS）、計(jì)算機(jī)、電子學(xué)、材料科學(xué)及生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的交叉，實(shí)現(xiàn)化學(xué)分析系統(tǒng)從試樣處理到檢測(cè)的整體微型化、自動(dòng)化、集成化與便攜化。微流控分析（Microfluidic Analysis）是微全分析系統(tǒng)的主要組成部分，而將化學(xué)分析的多種功能集成在郵票大小的芯片上的微流控芯片（Microfluidic chips）又是當(dāng)前最活躍的發(fā)展前沿，代表著21世紀(jì)分析儀器走向微型化、集成化的發(fā)展方向[3]。具有微小可控、功能集成的微流控芯片，能夠簡(jiǎn)化操作過(guò)程、加快分析速度，還可避免常規(guī)方法中樣品轉(zhuǎn)移所帶來(lái)的損失和污染，為病原微生物等的分析提供了一個(gè)新的平臺(tái)，對(duì)于發(fā)展強(qiáng)大的生物分子床邊快速診斷（Point of care testing，POCT）具有非常重大的意義[4-5]。

基于微流控芯片的核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（Nucleic acid amplification test，NAAT）是微流控技術(shù)最有前景的應(yīng)用之一，它簡(jiǎn)化了核酸擴(kuò)增檢測(cè)中繁瑣的樣品前處理和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)步驟。在多種NAAT檢測(cè)方法中，LAMP與微流控技術(shù)結(jié)合的核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)則最有潛力被應(yīng)用在POCT上[6]。近年來(lái)已有不少研究報(bào)道將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增與微流控芯片結(jié)合，用于檢測(cè)病原微生物、癌癥生物標(biāo)志物及其他靶基因[7-12]。本文就LAMP與微流控結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，以期為相關(guān)研究人員提供參考。

2 數(shù)字微流控環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

數(shù)字微流體（Digital microfluidics，DMF）是一種新興的液體操作技術(shù)，使單個(gè)微液滴可以在開放陣列的電極上受到控制[13]。DMF依賴于一種能夠建立電極電壓的電極排列架構(gòu)，它允許通過(guò)計(jì)算機(jī)的控制命令在集成系統(tǒng)的高精度下控制離散的微升級(jí)液滴。每一個(gè)液滴都可以被視為一個(gè)微型反應(yīng)器，增強(qiáng)其中發(fā)生的化學(xué)和生物反應(yīng)效率[14]。隨著微機(jī)電系統(tǒng)（MEMS）的不斷發(fā)展，微流控液滴技術(shù)被廣泛應(yīng)用于藥物傳輸、生物工程、疾病防護(hù)、化學(xué)分析、細(xì)胞研究和功能材料合成等諸多領(lǐng)域[15]。由于DMF的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，包括所需儀器簡(jiǎn)單、器件結(jié)構(gòu)靈活以及與其他技術(shù)易于耦合等，日益成為核酸擴(kuò)增POCT診斷的有力工具。

DMF裝置內(nèi)的核酸擴(kuò)增顯示了許多優(yōu)勢(shì)，與臺(tái)式處理過(guò)程相比，可減少試劑消耗高達(dá)40000倍，提高檢出限達(dá)100倍，提高反應(yīng)時(shí)間50%，并且使完全的自動(dòng)化流程變?yōu)榭赡?，從而降低了成本和交叉污染[14]。整合 DMF與 LAMP技術(shù)（DMF-LAMP）可以增強(qiáng)反應(yīng)靈敏性，而不會(huì)影響反應(yīng)效率或失去反應(yīng)的可靠性和功能。Coelho等設(shè)計(jì)了一種T-型DMF芯片，使用DMF-LAMP技術(shù)擴(kuò)增癌基因cmyc 0.5 ng/μL 靶 DNA 只需 45 min，LAMP 反應(yīng)液量只需1.54 μL，比標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)式反應(yīng)極大降低了反應(yīng)體積[14]。Wan等針對(duì)LAMP假陽(yáng)性問(wèn)題，開發(fā)了一種使用分子信標(biāo)DNA探針的病原體檢測(cè)DMF系統(tǒng)。該裝置能進(jìn)行低至1 μL樣品的高重復(fù)性LAMP反應(yīng)；在芯片上檢測(cè)未知病原體可在40 min內(nèi)完成；對(duì)布氏錐蟲基因組DNA的檢測(cè)限可達(dá)10拷貝/反應(yīng)。最重要的是，在此DMF系統(tǒng)上使用分子信標(biāo)DNA探針與LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中的特定序列結(jié)合，能夠克服LAMP假陽(yáng)性問(wèn)題，區(qū)分真正特異性產(chǎn)物及非特異性產(chǎn)物[16]。

3 蝶式環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微流控檢測(cè)技術(shù)

微流控恒溫?cái)U(kuò)增碟式芯片，是通過(guò)微加工構(gòu)建的微型離心式生化分析系統(tǒng)，可在一塊芯片上同時(shí)進(jìn)行數(shù)十個(gè)基因檢測(cè)反應(yīng)[17]。進(jìn)行基因檢測(cè)的離心設(shè)備，可集成控制旋轉(zhuǎn)速率及其他處理步驟等的所有分析步驟。這些微流控芯片系統(tǒng)一般由含有微結(jié)構(gòu)的圓形反應(yīng)平臺(tái)（通道、閥門、腔室等）組成，測(cè)量可采用標(biāo)準(zhǔn)的儀器，如比色計(jì)等昂貴的靜態(tài)探測(cè)器、熒光顯微鏡、掃描儀或其他復(fù)雜的非整機(jī)系統(tǒng)[18]。

Sara Santiago-Felip等提出了一種集成在光盤上的微型反應(yīng)器，用于實(shí)時(shí)靶向DNA測(cè)定。通過(guò)整合LAMP擴(kuò)增和光盤技術(shù)，該研究研制出一種稱為光盤LAMP（iD-LAMP）的方法。通過(guò)直接使用標(biāo)準(zhǔn)的音頻–視頻光盤（CD，DVD）作為生物傳感平臺(tái)來(lái)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，并通過(guò)光盤激光驅(qū)動(dòng)器掃描來(lái)讀取結(jié)果，DNA擴(kuò)增反應(yīng)及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)在光盤上即可進(jìn)行。該方法應(yīng)用于沙門菌的致病菌檢測(cè)和食品樣品中牛肉的鑒定結(jié)果顯示，對(duì)沙門菌和牛肉的檢出限分別為5CFU/mL和10mg/g，并可在15min內(nèi)進(jìn)行DNA定量分析。這些結(jié)果表明，iD-LAMP方法顯示了足夠的靈敏度，良好的工作范圍和可靠的重現(xiàn)性[18]。

Abkar Ahmed Sayad等開發(fā)出一種離心型微流控裝置，其中試劑制備、病原體LAMP檢測(cè)的主要步驟可以集成到一張簡(jiǎn)單的微流控光盤（CD）上。這個(gè)微流控CD包括用壓敏膠粘層（PSA）材料結(jié)合的頂部和底部的PMMA層。應(yīng)用電腦數(shù)控機(jī)器可將微流控CD的操作刻在PMMA層上。使用切刻機(jī)，在PSA層上刻繪微流控CD的其他操作，混合試劑、測(cè)量、等溫?cái)U(kuò)增和檢測(cè)的微流控腔室，刻在光盤的底層。LAMP實(shí)驗(yàn)的排氣和裝載孔、蠟、密封材料放在微流控CD頂層。當(dāng)三層完全制備好，使用一個(gè)自定義系統(tǒng)將它們對(duì)準(zhǔn)壓捆在一起，最后制成一個(gè)離心型微流控病原體檢測(cè)光盤。該裝置對(duì)添加沙門氏菌的番茄進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為5×10-3ng/μL。整個(gè)過(guò)程，從樣品制備到檢測(cè)在微流控CD上完全自動(dòng)化，在70 min 內(nèi)完成[19]。

Huang等設(shè)計(jì)了一種蝶式空氣絕緣微流控LAMP芯片，這種微流控芯片的基片和蓋片都是直徑為60 mm、厚度0.6 mm?；嫌?4個(gè)測(cè)試單元和相同數(shù)量的緩沖池。測(cè)試池的直徑為3 mm，深度為0.2 mm，體積為1.45 μm。將樣品自動(dòng)離心分至24個(gè)測(cè)試單元中，45 min內(nèi)可同時(shí)測(cè)定1.45 μL反應(yīng)體系中的多個(gè)臨床肺炎相關(guān)病原體，且無(wú)交叉污染。這種基于微流控芯片的便攜式LAMP核酸分析儀可以檢測(cè)低至10拷貝數(shù)的低豐度核酸。在一項(xiàng)雙盲實(shí)驗(yàn)中，特異性鑒別229例肺炎支原體、金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的臨床病人痰標(biāo)本，該檢測(cè)系統(tǒng)和傳統(tǒng)使用ABI 7500的RTPCR總符合率為99.56%。對(duì)僅占0.44%的4例不一致病例進(jìn)一步進(jìn)行基因測(cè)序顯示該系統(tǒng)報(bào)告了正確的結(jié)果[20]。

周杰等采用北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司RTisochipΤΜ-A 恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片分析儀，基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物樣品中的PCa MV35S、T-NOS、NPTⅡ、BAR、PAT、Cry1Ac、EPSPS I、EPSPS II、FMV35S 和 GM-HRA 等轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)進(jìn)行同步檢測(cè)。該碟式芯片共有24個(gè)樣品檢測(cè)孔，每孔體積為2.2 μL。在30 min以內(nèi)即可得到檢測(cè)結(jié)果，檢出限達(dá)到0.5%；且本試劑盒所消耗 LAMP試劑量?jī)H為普通反應(yīng)的1/2～1/3，大大降低了檢測(cè)成本，可廣泛應(yīng)用于常見轉(zhuǎn)基因作物的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)，為轉(zhuǎn)基因成分篩查提供了快速、靈敏的高通量檢測(cè)平臺(tái)[17]。

Zhou等運(yùn)用離心式聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）芯片熒光LAMP檢測(cè)法，成功實(shí)現(xiàn)了一類弧菌的芯片LAMP快速檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間僅用30 min，芯片LAMP擴(kuò)增較之常規(guī)LAMP擴(kuò)增，具有操作簡(jiǎn)便，擴(kuò)增速度快，便于攜帶，實(shí)時(shí)快速等優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)于常規(guī)LAMP檢測(cè)法耗材量大大降低[21]。

4 卡式微流控環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

卡式微流控芯片，即指美國(guó)Rheonix公司（Ithaca，NY）開發(fā)的微流控CARD芯片，集成了執(zhí)行全自動(dòng)分析所必需的所有泵、閥門、微通道、反應(yīng)和試劑儲(chǔ)液池，以及通用DNA陣列。該CARD芯片采用注塑成型的聚苯乙烯均聚物結(jié)構(gòu)，是一種可以對(duì)同一樣本既提供免疫又提供核酸檢測(cè)的整合微流控芯片[22-24]。每一張芯片都可以使4個(gè)單獨(dú)樣品同時(shí)進(jìn)行樣品裂解、純化、擴(kuò)增和雜交步驟。當(dāng)插入到工作站，工作站的軟件可控制6個(gè)平行芯片上的所有檢測(cè)步驟，從而允許對(duì)24個(gè)獨(dú)立樣品進(jìn)行同時(shí)分析。

Chen等使用CARD芯片提取人類免疫缺陷病毒（HIV）RNA大約用56 min，進(jìn)行RT-LAMP檢測(cè)需要20 min，分析靈敏度在每毫升103病毒顆粒（103vp/mL）范圍內(nèi)。此外，臺(tái)式RT-LAMP和CARD芯片上的分析結(jié)果顯示加入病毒與結(jié)果CT值的一致性，說(shuō)明CARD芯片具有與勞動(dòng)密集型的臺(tái)式LAMP同樣的處理能力[22]。Maite Sabalza等在Rheonix CARD芯片上采用LAMP和反向斑點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù)，使用固定在DNA陣列上的核酸探針對(duì)RT-LAMP所產(chǎn)生的特定寨卡病毒（ZIKV）擴(kuò)增子進(jìn)行了雜交監(jiān)測(cè)。該方法成功地利用LAMP-RDB技術(shù)檢測(cè)到ZIKV RNA，并得到了一種基于雜交斑點(diǎn)圖像密度的病毒載量半定量滴度，使用ZIKV添加唾液的檢出限低至8.57×102RNA拷貝/mL （6 RNA拷貝/反應(yīng)）[24]。

5 其他環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微流控檢測(cè)技術(shù)

Song等研制了一種簡(jiǎn)單易于操作，價(jià)格低廉，使用一次性POC微流控芯片的高度敏感RT-LAMP裝置用于ZIKV的快速檢測(cè)。該裝置包括了從樣品加入至檢測(cè)的所有操作單元。對(duì)芯片的熱控制，使用的是無(wú)電力化學(xué)加熱杯，在杯蓋的抽屜里放置一包鎂-鐵合金作為熱源，使用時(shí)通過(guò)杯蓋端口將自來(lái)水注入抽屜內(nèi)，與鎂-鐵合金發(fā)生作用產(chǎn)熱。一次性微流控芯片可進(jìn)行病毒核酸捕獲、濃縮、提純、等溫?cái)U(kuò)增和檢測(cè)，包含4個(gè)獨(dú)立的、多功能等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)器。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)不需要儀器而是用無(wú)色結(jié)晶紫染料（LCV）進(jìn)行目測(cè)，利用LCV在雙鏈DNA擴(kuò)增子的存在下發(fā)生顏色紫變的原理，直接用眼睛和/或用手機(jī)觀察記錄檢測(cè)結(jié)果，在不到40 min內(nèi)檢測(cè)口腔樣本中ZIKV的靈敏度為5個(gè)空斑形成單位（PFU）[25]。

此外，Hataoka等開發(fā)了一種LAMP反應(yīng)和擴(kuò)增產(chǎn)物超快電泳分析一體化的商品化微流控芯片，該芯片可以在15 min內(nèi)完成前列腺特異性抗原基因模板檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)23 fg/μL[26]。秦奎偉等研制出一種NOA81型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微流控芯片（NOA81 LAMP Microfluidic Chip，NLM-chip），并且成功地在病原微生物沙門菌的快速檢測(cè)鑒定中得到運(yùn)用[27]。管瀟等構(gòu)建了一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增集成式微流控芯片，檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，采用熒光原位檢測(cè)可得 10～105CFU的檢測(cè)范圍和10 CFU的檢出限，該微流控 LAMP芯片結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，具有較高的靈敏度和特異性[28]。

6 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與微流控技術(shù)相結(jié)合，不論是數(shù)字微流控環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、蝶式環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微流控檢測(cè)技術(shù)、卡式微流控環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)還是其他環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微流控檢測(cè)技術(shù)，均具有特異性強(qiáng)、敏感度高、耗樣量少、耗時(shí)短、檢測(cè)效率高、操作簡(jiǎn)便等諸多優(yōu)點(diǎn)。整合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增和微流控芯片技術(shù)，建立單重/多重、定性/定量LAMP微流控芯片模塊，發(fā)展快速、靈敏、特異和適合床邊檢測(cè)的生物分子分析技術(shù)，將為我國(guó)食品安全、重大傳染病防治、腫瘤及遺傳性疾病等的快速準(zhǔn)確診斷提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障，為創(chuàng)新技術(shù)的發(fā)展提供良好的示范和引導(dǎo)。

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