實驗動物的安樂死及其實施方法的倫理分析

李 楠，王天奇，何嘉玲，張長勇，暴 國，孫德明

(國家衛(wèi)生計生委科學技術(shù)研究所， 北京 100081)

隨著生物醫(yī)學技術(shù)的快速發(fā)展，實驗動物在多領(lǐng)域多學科的應(yīng)用日益廣泛，每年有數(shù)千萬的動物用于科學研究。人類對于實驗動物福利倫理及保護意識的逐漸增強，安樂死的問題受到了廣泛的關(guān)注。安樂死是實驗動物的關(guān)鍵性福利。然而，如何科學的選用恰當?shù)陌矘匪婪椒饶鼙ＷC動物福利又符合倫理道德標準、方便易行又不影響實驗結(jié)果的判定，是困擾很多科研工作者的一個難題。本文對國內(nèi)外應(yīng)用安樂死的現(xiàn)狀，實驗動物實施安樂死的若干問題進行闡述，并對國際上常用的幾種安樂死方法的優(yōu)缺點進行比較及倫理分析。

1 安樂死的實施背景

1.1 動物實驗的目的

應(yīng)用動物進行科學實驗的目的很多，在有些實驗中，所需要的組織或數(shù)據(jù)不能從活體動物獲取，需對動物執(zhí)行安樂死，才可進行后續(xù)的實驗。如癌癥研究需要對動物進行剖檢，觀察腫瘤是否轉(zhuǎn)移；神經(jīng)學研究項目是以在實驗動物體內(nèi)注射神經(jīng)解剖示蹤劑或進行組織病理學檢測，進而對病灶部位進行研究。在這些實驗中，實驗動物提供體外研究的細胞或組織。

1.2 實驗動物痛苦程度超過預(yù)期

在動物實驗中，不可避免的會對動物造成痛苦或傷害，有些傷害是可控的，但有些傷害是不可預(yù)期的，會對動物造成巨大痛苦。如動物持續(xù)處于應(yīng)激狀態(tài)時，其生理、病理均會發(fā)生較大的變化，此時獲得的動物實驗數(shù)據(jù)是不科學的、不準確的。因此，依據(jù)動物福利和動物保護的原則，實驗者應(yīng)在恰當?shù)臅r機采取恰當?shù)姆椒▽游镞M行安樂死，確保動物的痛苦降到最低。

1.3 動物實驗失敗或無法完成

動物實驗中，經(jīng)常出現(xiàn)意外的情況。當發(fā)現(xiàn)動物實驗已經(jīng)失敗，繼續(xù)實驗已經(jīng)無法得到有意義的結(jié)果時，應(yīng)實施仁慈終點：立即停止動物實驗。為盡早終止受試動物的實驗痛苦，應(yīng)實施安樂死。

1.4 其他不適合繼續(xù)繁殖或飼養(yǎng)的原因

安樂死是實驗中不需要的健康動物的默認選擇。如果動物因性別、年齡或基因型、或在某些科學研究中動物已經(jīng)進行了一些實驗，導(dǎo)致其無法用于其他實驗時，研究人員會從實驗中去除這些動物。但安樂死剝奪了健康動物的未來，目前國外正在嘗試尋找可靠的家庭來收養(yǎng)健康但不被需要的實驗室動物，使得這些動物除了安樂死外，還有其他的命運可以選擇。對于目前使用數(shù)以萬計的大小鼠和魚來說，采用此辦法是個不錯的選擇，但是轉(zhuǎn)基因動物由于其特殊性，不能采用此種方法[1-2]。

2 安樂死的執(zhí)行標準

當實驗動物的身體出現(xiàn)以下狀況，應(yīng)立即執(zhí)行安樂死：①體重減輕：當實驗動物體重減輕達原體重的20%～25%，或動物出現(xiàn)惡病質(zhì)或消耗性病癥。②食欲喪失：小型嚙齒類動物完全喪失食欲達到24小時或食欲不佳(低于正常食量50%達到3天。大動物完全喪失食欲達5天或食欲不佳(低于正常量之50%)達7天。③虛弱或瀕死：無法進食或飲水，動物在沒有麻醉或鎮(zhèn)靜的狀態(tài)下，長達24 h無法站立或極度勉強才可站立，或表現(xiàn)精神抑郁伴隨體溫過低(常溫動物低于37℃)。④嚴重感染：體溫升高白細胞數(shù)目增加，且抗生素已經(jīng)無效并伴隨動物全身性的不適癥狀。⑤腫瘤：自發(fā)性或?qū)嶒炐阅[瘤，均需仁慈終點評估。腫瘤生長超過動物原體重的10%，腫瘤平均直徑在成年小鼠超過20 mm、成年大鼠超過40 mm；體表腫瘤表面出現(xiàn)潰瘍、壞死或感染；腹腔異常擴張、呼吸困難；出現(xiàn)神經(jīng)精神癥狀。⑥動物預(yù)后不佳：出現(xiàn)器官嚴重喪失功能的臨床癥狀且治療無效，或經(jīng)實驗動物醫(yī)師判斷預(yù)后不佳：如呼吸困難、發(fā)紺、內(nèi)臟摘除手術(shù)；腎衰竭、中樞神經(jīng)抑制、肢體功能喪失、皮膚傷口無法愈合、重復(fù)性自殘或嚴重燙傷等[1]。

世界各地研究機構(gòu)可接受的小鼠腫瘤大小的標準也不同，爭議較大。Nature規(guī)定癌癥研究論文，腫瘤大小不應(yīng)超過15 mm；麻省總醫(yī)院IACUC動物福利指南中的限制規(guī)定也是15 mm。但這些并不具有廣泛的代表性；2010年一個癌癥研究小組發(fā)布的指南推薦的直徑不應(yīng)該超過12 mm。美國機構(gòu)指南通常推薦最大為20 mm，具有廣泛的代表性。按照中國動物福利的倫理審查國家標準規(guī)定的審查原則，即必要性原則來分析，當模型小鼠腫瘤超過20 mm，腫瘤疫病模型已經(jīng)完全形成，已不再具有可逆性，因此，沒有必要繼續(xù)生長，使動物遭受更大的和不必要傷害。

安樂死的倫理判定，應(yīng)遵循國家標準有關(guān)安樂死的原則性要求[3]。并應(yīng)該讓熟悉動物的獸醫(yī)、實驗人員和倫理審查人員從專業(yè)的角度來共同決定安樂死執(zhí)行的最佳時機，最大程度的減少動物痛苦。

3 安樂死前的動物福利

在動物執(zhí)行安樂死前，必須確保實驗動物享有其本應(yīng)享有的福利待遇。一旦動物被確定執(zhí)行安樂死，研究人員必須準備迅速的采取行動，因其他事由導(dǎo)致的延遲會增加實驗動物的痛苦。在安樂死執(zhí)行之前，房間里的動物越多，它們相處的時間越長，群體間壓力和潛在侵略性就越大。動物生命的最后時刻，不應(yīng)使其再經(jīng)歷生疏環(huán)境與其他動物和人類操作的驚擾和產(chǎn)生的緊張及驚嚇[34]。在安樂死實施過程中，應(yīng)予以溫和的處理方法，遵循恰當使用鎮(zhèn)定劑或麻醉劑的原則。

4 現(xiàn)行安樂死方法比較及倫理分析

如何判斷一種安樂死方法是否人道？這是一個獨一無二的難題，由于動物無法說出它們的感受，人類很難解讀動物行為。但人類在了解動物福利的影響方面取得了重大進展。

目前采用安樂死的方法主要分為三種，非吸入性麻醉法、吸入法和物理法。非吸入性麻醉法即為過量用藥，如應(yīng)用巴比妥類藥物過量麻醉；吸入法為應(yīng)用二氧化碳、一氧化碳或氮氣等氣體替換氧氣，或用吸入性麻醉藥，如異氟醚、乙醚等；物理方法包括頸椎脫位、斷頭術(shù)、窒息、冰凍、微波輻照等，

4.1 非吸入性麻醉劑

通過注射過量的藥物，使動物迅速死亡，是非?？煽康膭游锇矘匪婪椒?。注射性麻醉劑有多種給藥方式，靜脈注射是最佳選擇。目前在藥物選擇中，應(yīng)用過量的巴比妥類及其衍生物的藥物是對動物執(zhí)行安樂死的優(yōu)選方法，適宜的動物種類包括嚙齒類動物、兔、犬、貓、非人靈長類動物、豬、牛、馬、兩棲動物、爬行動物、家禽，應(yīng)用范圍較廣，巴比妥類藥物會導(dǎo)致意識快速喪失繼而呼吸停止，但有些個體注射時會誘發(fā)持續(xù)的興奮期繼而喪失意識。由于小動物(如大鼠、小鼠等)靜脈注射比較困難，通常會采用腹腔注射巴比妥。但腹腔注射巴比妥會因其堿性而導(dǎo)致動物腹部扭曲造成疼痛，因此在會在麻醉劑中加入局麻藥(利多卡因)顯著緩解因巴比妥注射而引發(fā)的傷害[1]。對于大動物，較為公認的最好的方法是：首先給予安定劑，待動物進入安靜狀態(tài)時，再行靜脈注射過量的巴比妥酸鹽，該法可最大限度地減少動物的緊張和掙扎。

注射巴比妥藥物的優(yōu)點在于可以平穩(wěn)的誘導(dǎo)并麻醉動物，因為其效果依劑量、濃度和投藥方式而不同，可使動物的不適反應(yīng)降到最低，失敗的可能性低于物理方法，可以保留完整的身體結(jié)構(gòu)。

注射巴比妥類藥物的缺點在于要提高對于獲取、存儲、使用及記錄相關(guān)藥品的要求，與物理方法相比較慢，一次僅能殺死一只動物；藥物會對組織造成污染；如果安樂死的動物被其他動物所吃掉，有藥物殘留的風險，并會對某些研究項目中的肝臟或其他生理功能產(chǎn)生影響。目前美國允許將氯胺酮及三溴乙醇單獨或共同用藥執(zhí)行動物安樂死，但阿片類藥物作用比較緩慢，不是真正的麻醉藥。因此，不推薦過量應(yīng)用阿片類藥物作為安樂死的方法。

使用巴比妥類會引起一些動物福利問題，包括抓取動物進行注射而導(dǎo)致的應(yīng)激；在血管周圍注射溶液后潛在的疼痛；劑量沒有掌控好，沒有進行死亡的驗證，有潛在復(fù)蘇的可能。這種安樂死方法需要采用輔助的方法確認動物是否死亡；需要對人員開展準確實施腹腔注射或靜脈注射的相關(guān)培訓(xùn)。

4.2 吸入性麻醉劑

4.2.1 二氧化碳法

動物暴露于二氧化碳中，二氧化碳會從環(huán)境中進入肺泡，然后是血液，當大腦中二氧化碳含量到達一定濃度，會導(dǎo)致意識喪失繼而死亡。這是處死實驗嚙齒動物最廣泛使用的方法。出生一天雛雞使用二氧化碳的安樂死效果良好，在農(nóng)業(yè)上，也廣泛用于處死家禽和豬。該方法簡單、安全、有效、廉價、不污染組織。但由于二氧化碳與水發(fā)生反應(yīng)，在濕潤組織中生成酸，酸會產(chǎn)生刺痛的感覺，使動物在喪失意志前感受到痛苦。二氧化碳的濃度越高，動物失去意識的時間就越短，反之，當二氧化碳濃度增長緩慢時，也會延長動物失去意識的時間。

目前沒有科學研究表明動物短暫的明顯疼痛與長時間慢性疼痛相比是更好還是更差。有研究表明二氧化碳濃度超過50%會引發(fā)人類的疼痛，在嚙齒類動物的鼻、眼的上皮細胞中，存在相似密度的類似傷害感受器，傷害感受器會對類似濃度的二氧化碳作出厭惡反應(yīng)。有科學家研究表明安樂死前預(yù)先填充10%～30%的二氧化碳效果較好。在加拿大管理動物安樂死中，建議每分鐘填充20%～30%的二氧化碳。在緩慢充氣過程中，二氧化碳達到可能引發(fā)疼痛的濃度前，動物已經(jīng)被麻醉了。在預(yù)充或快充過程中，動物在暴露于50%濃度之前，已經(jīng)喪失意識了[5-6]。

應(yīng)用二氧化碳是一種安全的、低成本的技術(shù)，要求不高，可同時殺死多只動物。在通風良好的場所配合適當?shù)脑O(shè)備使用時，比其他藥劑安全；操作者能以最低的風險對動物進行安樂死，不破壞身體結(jié)構(gòu)(且二氧化碳不會污染任何組織)。

二氧化碳吸入法的缺點在于由于二氧化碳比空氣重，在容器內(nèi)尚未灌滿時，動物往往將頭部抬高而難以迅速死亡；有些動物對二氧化碳的耐受性較高，如牛、馬等大型動物、魚類、水中哺乳類、新生嚙齒類動物，往往無法有效的吸入足量的二氧化碳，需要較長時間操作才能完成安樂死。

使用二氧化碳會引起一些動物福利問題，很多研究都發(fā)現(xiàn)動物對較低濃度二氧化碳厭惡。有證據(jù)表明20%二氧化碳即可激活大鼠的恐慌[7]。在執(zhí)行二氧化碳的安樂死過程中，目前還沒有辦法可以讓動物免于痛苦(除非動物用非抑制性麻醉劑預(yù)先麻醉)。為保證動物減少痛苦，可以采取漸近式充氣(每分鐘小于40%)避免引發(fā)疼痛。如果在動物飼養(yǎng)籠中處死動物，應(yīng)盡可能避免抓取應(yīng)激，在動物放松(甚至睡著)狀態(tài)下飼養(yǎng)籠內(nèi)實施處死操作，從而減少“過程性應(yīng)激”。同時應(yīng)結(jié)合其他物理方法，如放血、斷頭等確認動物死亡。

4.2.2 其他吸入性麻醉劑

鹵代類吸入麻醉劑如異氟醚、七氟醚、氟烷等，可以用作實驗室的嚙齒類動物的麻醉劑，應(yīng)用過量的吸入性麻醉劑執(zhí)行安樂死也是一種較好的選擇，可以作為二氧化碳的替代方案。缺點是當動物暴露于致死劑量的麻醉劑時，許多物種的動物均顯示出相同的厭惡和應(yīng)激行為，與暴露于二氧化碳的動物表現(xiàn)一樣。此外，當動物進入吸入性麻醉劑容器中，由于麻醉劑量被容器設(shè)置成亞致死濃度，因此，安樂死的過程非常緩慢；在執(zhí)行安樂死的過程中，為增加容器內(nèi)麻醉劑的濃度，會在容器內(nèi)放入被麻醉劑浸泡過的紗布，刺激性的液體可能會直接接觸動物。有些動物對高濃度的鹵代類吸入麻醉劑有一些厭惡，但是不會像應(yīng)用高濃度二氧化碳那樣誘發(fā)疼痛[8]。但在大多數(shù)情況下，并沒有找到這些替代物可以替換二氧化碳的優(yōu)勢。除去對動物福利的關(guān)注，揮發(fā)性麻醉劑是環(huán)境污染物，與二氧化碳相比毒性更大。

目前有研究利用氮氣和氬氣來替換氧氣.盡管對嚙齒類動物來說，缺氧是痛苦的，但當豬暴露于氦氣時，其痛苦較小?？缥锓N的安樂死方法需要謹慎，在氮誘導(dǎo)缺氧的安樂死方法中得到了較好的驗證。雖然大多數(shù)哺乳動物對氮誘導(dǎo)缺氧厭惡，但是，在家禽類應(yīng)用效果較好，實驗證明，嚙齒類動物和水貂是不可應(yīng)用氮氣進行安樂死，但是在豬和家禽類是可以接受的[3]。

應(yīng)用一氧化氮安樂死會誘發(fā)動物失去意識。一氧化氮不僅會使動物遭受痛苦，也會對人的安全造成威脅，因此不推薦使用。乙醚對黏膜具有刺激性，易燃。乙醚一般用于實驗室安樂死，如肝細胞的收集測定等。

4.3 物理方法

物理的安樂死方法主要有頸椎脫位、撞擊頭部、斷頭、放血、微波刺激等；物理法只要在良好的技巧及適當?shù)墓ぞ叩呐浜舷?，能迅速使動物解除疼痛死亡。但是未受過訓(xùn)練的人去實施物理性方法，不僅容易造成人員受傷，更可能使動物因未完全死亡而造成極大的痛苦。有些方法，如放血、腦脊髓穿刺等，不建議作為動物安樂死的單一方法，配合其他方法使用較好。

對于一些小動物(如嚙齒動物、禽類、仔兔、鳥類)斷頭和頸椎脫位被認定為是可接受的方法，但其關(guān)鍵在于操作者的技能。為保證動物福利，物理性安樂死方法的最佳做法是對操作人員進行系統(tǒng)的培訓(xùn)。相對而言，斷頭不是理想的方法，但由于爬行動物和兩棲動物的中樞系統(tǒng)對腦缺氧相對不敏感，因此斷頭是它們執(zhí)行安樂死的唯一選擇，如對此類動物進行安樂，應(yīng)先進行鎮(zhèn)靜，目的是迅速抑制維持意識的腦中樞[9-10]，減少動物痛苦。

目前，國際上可以接受的專業(yè)物理方法通常使用專門微波設(shè)備及低溫設(shè)備。對于斑馬魚，應(yīng)將其快速浸入冰水中造成低體溫，迅速引發(fā)冷休克[11-12]；對于新生嚙齒動物，推薦緩慢冷卻，無需直接將它們放在預(yù)冷的表面，放在預(yù)冷的表面會在低體溫誘發(fā)無意識之前引發(fā)疼痛。

物理方法的優(yōu)點在于這種方法通常很便宜，無化學藥劑污染組織，執(zhí)行完成度高，且僅需要很少的設(shè)備或不需要設(shè)備，快速；缺點在于：對操作者的技術(shù)要求較高，如操作技術(shù)不佳，恐無法使動物迅速死亡，而導(dǎo)致動物的更大痛苦；不適用于保持動物頭/頸部完整的研究；一次只能殺死一只動物；在抓取和保定的時候可能導(dǎo)致動物緊張。

從動物福利角度來說，在物種合理的情況下，物理方法是最合適的安樂死方法，可以避免或減小動物死亡前所承受的不必要的疼痛和痛苦，但是對實施安樂死的人員感官刺激較大，需要加強實驗者的心理培訓(xùn)[13]；并且所有的物理方法均會產(chǎn)生創(chuàng)傷，對動物和人都存在潛在的危險，因此，對于操作數(shù)熟練程度是至關(guān)重要的。

5 小結(jié)

選擇不恰當?shù)陌矘匪婪椒〞箘游镌馐芫薮笸纯?，因此，在每項研究中要始終考慮最佳的安樂死方法，考慮要素包括：動物的福利性、科學性、實踐性和動物種類等，并不是所有方法都適用于所有動物和每一次特定的實驗，應(yīng)根據(jù)實驗要求，選擇恰當?shù)陌矘匪婪椒ㄊ侵陵P(guān)重要。