紫外-可見(UV-Vis)光譜法在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥工程學(xué)院，天津 300193；2. 浙江大學(xué)藥物信息學(xué)研究所，浙江 杭州 310058

紫外可見光譜(Ultraviolet-visible spectroscopy, UV-Vis)是指波長(zhǎng)范圍在200～760 nm之間的波段，該波段屬于電子光譜，是由于價(jià)電子的躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜。利用物質(zhì)的分子或離子對(duì)紫外和可見光的吸收所產(chǎn)生的UV-Vis光譜及吸收程度可以對(duì)物質(zhì)的組成、含量及結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析、測(cè)定和推斷。UV-Vis光譜用于具有紫外、可見光吸收物質(zhì)的檢測(cè)，靈敏度高，特征性好，在中藥質(zhì)量控制得到了廣泛的應(yīng)用。本文對(duì)UV-Vis光譜法在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行展望，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供參考。

1 比色法測(cè)定多種大類物質(zhì)的含量

比色法(colorimetry)是通過比較或測(cè)量有色物質(zhì)溶液顏色深度，并根據(jù)朗伯比爾定律確定待測(cè)組分濃度或含量的方法。常用的檢測(cè)波段是UV-Vis波段，雖然該方法是一種歷史悠久的傳統(tǒng)分析方法，但目前在中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域仍被廣泛應(yīng)用。

蘇玉順等[1]對(duì)UV-Vis光譜法測(cè)定植物多糖含量過程中的顯色劑選取、測(cè)定條件的優(yōu)化以及具體應(yīng)用進(jìn)行了分析，具有較好的參考價(jià)值。古炳明等[2]采用UV-Vis分光光度法建立了巴豆中可溶性蛋白含量的測(cè)定方法，檢測(cè)波長(zhǎng)為593 nm，巴豆中可溶性蛋白在0.010 3～0.103 0 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均回收率為98.37%，RSD為1.01%，該方法簡(jiǎn)單、方便、專屬性強(qiáng)，可為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。石婷婷等[3]采用UV-Vis方法考察了不同廠家腦得生片物質(zhì)組釋放特征，以UV-Vis法測(cè)定并計(jì)算各供試品溶液的物質(zhì)組濃度及釋放度，并采用Weilbull分布進(jìn)行曲線擬合，考察了不同釋放度測(cè)定裝置、不同釋放介質(zhì)和不同攪拌槳轉(zhuǎn)速對(duì)腦得生片物質(zhì)組釋放度的影響，并測(cè)定了不同廠家腦得生片物質(zhì)組釋放度。楊連菊等[4]采用UV-Vis測(cè)定了馬應(yīng)龍痔瘡膏中氧化鋅的含量，研究采用鋅試劑顯色的方法，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，結(jié)果表明，該方法與絡(luò)合滴定法相比，準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于測(cè)定爐甘石藥材及飲片中氧化鋅的含量。

采用比色法進(jìn)行大類物質(zhì)測(cè)定時(shí)，有些可以直接利用待測(cè)物質(zhì)特征結(jié)構(gòu)對(duì)于UV-Vis波段的吸收進(jìn)行測(cè)定，有些則需要先采用顯色劑與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合、反應(yīng)，從而產(chǎn)生UV-Vis波段的吸收，然后再進(jìn)行測(cè)定。采用前一種方式，往往待測(cè)中藥體系中其他雜質(zhì)會(huì)對(duì)測(cè)定造成較大干擾，影響方法的選擇性；而采用顯色法，往往又因?yàn)椴僮鬟^程復(fù)雜，顯色條件難以準(zhǔn)確控制等原因，導(dǎo)致方法的穩(wěn)定性較差。另外，采用比色法測(cè)定大類物質(zhì)含量，往往是選擇一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所測(cè)含量為這種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的折合含量，因此，采用不同標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)得的大類成分含量不具有可比性。

2 作為高效液相色譜(HPLC)分析方法的檢測(cè)器

目前，高效液相色譜(HPLC)法最為常用的檢測(cè)器是UV或DAD檢測(cè)器，它是利用特定化合物在UV波段的特征吸收值與一定濃度之間的線性關(guān)系，對(duì)特定物質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定的。一般而言，對(duì)于含有共軛雙鍵或苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，其特征吸收明顯，可選擇其特征吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)于末端吸收或無明顯特征吸收的化合物，可利用末端的非特征吸收波長(zhǎng)，或者通過對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行衍生化處理，使其具有特征吸收，從而進(jìn)行檢測(cè)。非特征吸收檢測(cè)波長(zhǎng)，一般靈敏度、選擇性稍差，衍生化處理則復(fù)雜耗時(shí)、經(jīng)常使用有毒性的衍生化試劑，對(duì)于這類成分而言，UV并非上選，推薦使用其他類型的檢測(cè)器，比如蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器等。

周惠芬等[5]以蘆丁為對(duì)照品，檢測(cè)波長(zhǎng)272 nm，建立了UV-Vis整體考察補(bǔ)陽還五湯總黃酮含量方法，并采用HPLC方法同時(shí)檢測(cè)了補(bǔ)陽還五湯總黃酮中毛蕊異黃酮、芒柄花素、羥基紅花黃色素A的含量。結(jié)果表明，所建方法簡(jiǎn)單便捷，重現(xiàn)性好，有利于補(bǔ)陽還五湯中總黃酮的質(zhì)量控制。該課題組還采用類似的方法對(duì)養(yǎng)陰通腦顆粒有效部位的質(zhì)量控制[6]。值得注意的是，用于測(cè)定總黃酮的含量，需要進(jìn)行較為復(fù)雜的前處理，而采用HPLC測(cè)定多種黃酮類物質(zhì)，前處理則相對(duì)簡(jiǎn)單，而且黃酮類物質(zhì)具有較好的紫外吸收特性，便于進(jìn)行直接測(cè)定。黃翔等[7]建立同時(shí)測(cè)定丹紅注射液中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A含量的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)方法，結(jié)果表明，樣品中6種成分分離良好，線性關(guān)系良好，該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可為丹紅注射液的質(zhì)量控制提供參考。

對(duì)于氨基酸、糖、膽酸等UV-Vis波段無特征吸收的化合物，常采用柱前衍生化的方法進(jìn)行預(yù)處理。陳萍紅等[8]采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定阿膠中13種氨基酸的量。該方法將阿膠以6 mol/L鹽酸于120℃水解3 h，以異硫氰酸苯酯柱前衍生，用反相高效液相色譜法測(cè)定氨基酸的量。檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。結(jié)果在36 min內(nèi)可完成對(duì)阿膠中13種氨基酸的分離測(cè)定，各氨基酸的峰面積與濃度的線性關(guān)系良好，加樣回收率為95.2%～104.4%，RSD<5.0%。方法準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于阿膠的質(zhì)量控制，亦可為其他藥物中氨基酸的分析提供參考。楊歡等[9]建立了柱前衍生HPLC-UV同時(shí)測(cè)定人工牛黃中膽酸及豬去氧膽酸的含量。方法以2-萘基溴甲基酮為衍生試劑，三乙胺為催化劑，60℃水浴條件下對(duì)膽酸及豬去氧膽酸進(jìn)行衍生，考察衍生試劑用量、催化劑用量及反應(yīng)時(shí)間等對(duì)衍生產(chǎn)物的影響，確定衍生反應(yīng)的條件，然后考察建立HPLC-UV分離檢測(cè)方法對(duì)人工牛黃中膽酸及豬去氧膽酸含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，當(dāng)衍生試劑的摩爾量與膽酸及豬去氧膽酸的摩爾總量的比大于30∶1，催化劑的摩爾量與兩者的摩爾總量的比在5∶1～60∶1范圍內(nèi)，在60℃水浴條件下反應(yīng)50 min時(shí)，膽酸及豬去氧膽酸的衍生物反應(yīng)完全。膽酸在0.4～5.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 5)；豬去氧膽酸在0.12～1.5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 8)。膽酸的平均回收率(n=6)為100%，RSD為2.40%；豬去氧膽酸的平均回收率(n=6)為101%，RSD為1.33%。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定性和重復(fù)性好，可用于測(cè)定人工牛黃中膽酸及豬去氧膽酸的含量。類似的工作還有很多[10-11]。當(dāng)然，也可采用末端吸收進(jìn)行直接測(cè)定，彭波等[12]建立了RP-HPLC法測(cè)定熊去氧膽酸片中熊去氧膽酸含量的方法，該方法直接使用205nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果表明熊去氧膽酸片中熊去氧膽酸及有關(guān)物質(zhì)在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。測(cè)試方法精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性尚可，平均回收率為98.5%～100.4%，將該方法應(yīng)用于熊去氧膽酸中熊去氧膽酸及相關(guān)物質(zhì)含量的測(cè)定具有簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，能有效控制熊去氧膽酸片的質(zhì)量。

3 紫外可見光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)的結(jié)合使用

將紫外光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，對(duì)全波段的紫外吸收光譜進(jìn)行多變量數(shù)據(jù)分析，此方法已被廣泛應(yīng)用于制藥行業(yè)的化學(xué)反應(yīng)監(jiān)測(cè)、食品品質(zhì)鑒別及含量測(cè)定等領(lǐng)域[13-16]，可借鑒用于中藥質(zhì)量控制。常用的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法方法包括多元線性回歸(MLR)、主成分回歸(PCR)、PLSR、多元曲線分辨(MCR)，以及聚類、判別分析方法等等。

吳柄樺等[17]研究紫外-可見-短波近紅外漫反射光纖光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)應(yīng)用于鑒別白芷、葛根、當(dāng)歸、白術(shù)、白芍五種外觀相似的中藥材的可行性，對(duì)制樣方法、光譜獲取、特征信息提取、光譜預(yù)處理、數(shù)學(xué)模型的建立進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立一種簡(jiǎn)便、快速鑒別中藥材的方法，為中藥材質(zhì)量控制提供有價(jià)值的參考。朱向榮等[18]采用支持向量機(jī)對(duì)清開靈注射液六混中間體的UV光譜進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)4個(gè)批次的中藥清開靈注射液六混中間體以及其混和批次共147個(gè)樣本的鑒別。區(qū)曉云等[19]將UV光譜用于監(jiān)測(cè)陳皮中橙皮苷的提取工藝研究，可對(duì)煎煮過程中橙皮苷的溶出濃度進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。孟慶華等[20]研究了UV光譜相似度在中藥注射液質(zhì)量控制中的應(yīng)用，采用UV吸收光譜上所有數(shù)據(jù)點(diǎn)計(jì)算樣品紫外光譜與多個(gè)對(duì)照品的光譜相似度，可以靈敏地反映譜圖間的差異，通過與閾值的比較對(duì)樣品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，UV光譜相似度法可作為中藥注射液質(zhì)量控制的一種定性分析方法。邢麗紅等[21]建立應(yīng)用紫外光譜快速測(cè)定金銀花提取物中5種有機(jī)酸含量的方法，該方法以HPLC法為參照，測(cè)定金銀花提取物中綠原酸、咖啡酸、3,4-二咖啡?？鼘幩?、3,5-二咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩岬?種有機(jī)酸類成分的含量。在220-400 nm范圍內(nèi)掃描金銀花提取物溶液的紫外吸收光譜,采用偏最小二乘回歸(PLSR)法分別建立樣品紫外吸收光譜與5種有機(jī)酸含量之間的校正模型，并對(duì)模型的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行考察。結(jié)果表明，5個(gè)校正模型對(duì)預(yù)測(cè)集樣本的預(yù)測(cè)值與對(duì)照值的相關(guān)系數(shù)都在0.90以上，相對(duì)預(yù)測(cè)誤差較小，預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，該方法操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確，可作為金銀花提取物中有機(jī)酸含量測(cè)定的一種快速分析方法。鄭辛甜等[22]建立了一種在線UV光譜采集系統(tǒng)，用于實(shí)時(shí)記錄反應(yīng)過程光譜，并采用MCR-ALS方法辨析化學(xué)變化信息，獲取反應(yīng)體系中目標(biāo)組分的定性和定量信息。將上述方法應(yīng)用于丹酚酸B、丹酚酸A 和黃芩苷的降解和轉(zhuǎn)化過程，初步定量闡釋了上述3種中藥化學(xué)成份的降解規(guī)律。

4 結(jié)論

雖然目前各種光譜技術(shù)及其他色譜檢測(cè)技術(shù)不斷涌現(xiàn)，但UV-Vis波段作為一種選擇性強(qiáng)、可解釋程度高、與目標(biāo)成分線性關(guān)系明確的檢測(cè)技術(shù)，仍有廣泛的應(yīng)用前景。但可以預(yù)言，UV-Vis光譜檢測(cè)將由單波長(zhǎng)檢測(cè)向多波長(zhǎng)檢測(cè)，固定波長(zhǎng)檢測(cè)向全光譜檢測(cè)方向發(fā)展，而紫外-可見波段所蘊(yùn)含的豐富的信息，也必將在化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的輔助下，得到更為充分的應(yīng)用。同時(shí)，作者認(rèn)為，衍生化方法也必將因其操作繁瑣、使用毒性試劑、重復(fù)性較差等缺點(diǎn)，而被逐步淘汰，因此，對(duì)于目前仍需要借助衍生顯色的分析方法，必須盡快尋求新的替代方法。