矢荅剌知丸對大鼠腦缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，寧夏 銀川 750001；3.回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004

腦血管病作為神經(jīng)系統(tǒng)最常見的疾病，是目前今主要的公共健康問題之一。隨著老年人口的不斷增長和生活水平的提高，腦血管病對中老年人的健康狀況構(gòu)成嚴(yán)重威脅。隨著醫(yī)療水平的迅速發(fā)展，目前對腦血管病的診治水平不斷提高，但該病具有發(fā)病率高，復(fù)發(fā)率高、致殘率高和病死率高的特點(diǎn)，已成為中老年人死亡的主要原因之一[1]。引起該病的重要原因——腦組織缺血使得腦神經(jīng)功能受到影響，進(jìn)而對腦組織造成損傷，引發(fā)彌漫性或局灶性腦功能障礙。但是關(guān)鍵致病原因--腦缺血再灌注后對腦神經(jīng)功能造成的損傷卻是近年來關(guān)注的重點(diǎn)。腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的損傷主要表現(xiàn)為壞死和凋亡，梗死灶中心地帶細(xì)胞壞死為主要的死亡形式，腦缺血后即刻死亡，而在梗死灶周邊區(qū)即半暗帶區(qū)，凋亡為主要的細(xì)胞死亡形式。且缺血再灌注時間與神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)成正比，至24～48 h 達(dá)峰值，時間持續(xù)數(shù)周之久[3]。作為一種遲發(fā)性的死亡細(xì)胞，也是梗塞灶形成、擴(kuò)大的主要原因。因此尋求靶向治療藥物抑制或延緩缺血半暗帶細(xì)胞的凋亡，已成為治療腦血管病的風(fēng)向標(biāo)。

回族醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，腦主總覺，起主導(dǎo)作用。冷(寒) 盛，剮腦于陽外，阻滯“通”使傳導(dǎo)能力，凝滯經(jīng)絡(luò)不得通達(dá)于外，影響機(jī)體知覺運(yùn)動，神經(jīng)-體液系統(tǒng)亦不得正常轉(zhuǎn)輸[4]。矢荅剌知丸出自回醫(yī)四大經(jīng)典之一《回回藥方》，是書中記載治療腦血管疾病的經(jīng)典方。原方由柴胡、黑訶子各一兩，蘆薈二兩，失答剌知(元胡)、菖蒲、番鹽各等二錢，沙哈木罕合里(藥西瓜油)、阿里公、安息香、撒額冰各三錢，干姜、胡椒、蓽撥、白芥子、蕓香各一錢，撒吉木你牙(巴豆)二錢，砂糖五錢上干者為末，用剌夫失水(芹菜水)化開，為丸。每服二錢至三錢，熱水送下。原文記載專治“骨節(jié)疼痛，左癱右瘓，口眼歪斜，半身不遂，能開纏腸肚風(fēng)病，最通經(jīng)絡(luò)?！庇^其方藥組成運(yùn)用大量香藥，取其芳香通竅、化積散結(jié)、祛痰利濕之功效?；蒯t(yī)認(rèn)為多因感觸寒冷，飲食不潔，情志內(nèi)傷所致腦竅失養(yǎng)，精不填髓，痰濕留駐而發(fā)病，素體多寒濕，病久致虛而發(fā)病，因此治則多以散、通、利為主，由此可見矢荅剌知丸適用于中醫(yī)中風(fēng)痰濕所致的半身不遂、口眼歪斜等證。本項(xiàng)目組前期研究成果表明，經(jīng)矢荅剌知丸對大鼠腦缺血再灌注損傷的干預(yù)，可降低損傷區(qū)炎性反應(yīng)，減少或延緩半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減少大鼠腦組織梗死灶面積，保護(hù)神經(jīng)腦組織，促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)血管的修復(fù)等方面具有明顯的治療作用?，F(xiàn)將研究綜述如下。

1 矢荅剌知丸抗炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制

作為人體最為敏感的器官--大腦，當(dāng)出現(xiàn)腦缺血時即刻引起腦細(xì)胞的凋亡和壞死，經(jīng)藥物治療及自身的應(yīng)激反應(yīng)，大腦側(cè)支循環(huán)的建立使得大腦恢復(fù)血供，然而大腦的缺血再灌注引起的損傷激活了炎癥信號通路，通過炎癥細(xì)胞的激活、浸潤及黏附分子的合成引發(fā)大腦一系列應(yīng)激炎癥級聯(lián)反應(yīng)，使得腦缺血再灌注損傷轉(zhuǎn)為炎癥反應(yīng)的損傷[5，6]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血再灌注模型出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)行為功能損傷，急性期血清IL-6和hs-CRP濃度呈持續(xù)增長狀態(tài),尤其2天的變化最明顯，經(jīng)失答刺知丸治療后血清中炎癥因子IL-6和hs-CRP濃度逐漸下降, 隨著再灌注和藥物干預(yù)時間的延長，腦缺血再灌注大鼠模型的神經(jīng)行為功能不同程度的恢復(fù)，效果理想[7]。提示矢荅剌知丸可降低損傷區(qū)炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子濃度，對促進(jìn)腦細(xì)胞功能恢復(fù)及保護(hù)腦組織有一定的治療作用。研究進(jìn)一步證實(shí)[8]矢荅剌知丸可通過降低大鼠腦缺血再灌注模型核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB的表達(dá)，發(fā)揮抑制炎癥細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，使得矢荅剌知丸對腦組織神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制更有說服力。

2 矢荅剌知丸抗凋亡機(jī)制的研究

腦缺血發(fā)生，缺血灶中心帶即刻發(fā)生不可逆的死亡，然而缺血半暗帶細(xì)胞則已緩慢死亡的形式發(fā)生，即為凋亡。因此，如何挽救半暗帶細(xì)胞的死亡，延緩或抑制凋亡，成為治療腦血管病的有利途徑[9]?；诖?，項(xiàng)目組做了一系列有關(guān)抗凋亡的研究。

項(xiàng)目組實(shí)驗(yàn)研究表明[10]，PI3-K/AKT 信號傳導(dǎo)通路是重要的抑制細(xì)胞凋亡的通路，通過多種神經(jīng)細(xì)胞的綜合作用激活PI3-K/AKT 信號通路，聯(lián)動一系列抗凋亡的機(jī)制，保護(hù)腦組織，發(fā)揮腦保護(hù)的作用。經(jīng)矢荅剌知丸給藥的大鼠腦缺血再灌注模型表明，當(dāng) PI3-K表達(dá)增高時，其下游 AKT 表達(dá)也增高，且隨著缺血再灌注時間的延長，矢荅剌知丸7天組的PI3-K和AKT表達(dá)最高，神經(jīng)功能恢復(fù)的最明顯。為進(jìn)一步明確具體是哪些蛋白在發(fā)揮抗凋亡的作用，項(xiàng)目組進(jìn)行深入的研究，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)[11], Bc1-2 及 Bax 蛋白作為抗凋亡及促凋亡的兩個重要蛋白，二者比例表達(dá)的高低對衡量治療腦血管病的效果尤為密切。經(jīng)矢荅剌知丸灌藥的大鼠腦缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn)，矢荅剌知丸可上調(diào)Bc1-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax 蛋白的表達(dá)，提示矢荅剌知丸具有良好的抗凋亡的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Bc1-2 及 Bax 蛋白兩者的比例有關(guān)系。

項(xiàng)目組還發(fā)現(xiàn)Caspase家族同樣介導(dǎo)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[12]，Caspase 家族在細(xì)胞凋亡的過程中占據(jù)關(guān)鍵地位，可直接介導(dǎo)凋亡細(xì)胞解體，其家族因子的活化是凋亡通路始動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中Caspase-3和Caspase-9為Caspase家族的代表因子。經(jīng)試驗(yàn)觀察矢荅剌知丸可明顯降低大鼠腦缺血再灌注模型中Caspase-3和Caspase-9因子的表達(dá)，減少細(xì)胞的凋亡率。此外項(xiàng)目組還對熱休克蛋白HSP70 (一種腦缺血、缺氧時就有保護(hù)性作用的應(yīng)激蛋白)進(jìn)行了研究[13]，其結(jié)論同具有說服力。項(xiàng)目組通過對矢荅剌知丸抗凋亡機(jī)制的長期研究，理論依據(jù)已日趨成熟，從抗凋亡信號通路的研究到具體的促凋亡及抗凋亡蛋白及凋亡因子家族的研究。綜上所述，矢荅剌知丸可激活抗凋亡信號通路，通過上調(diào)抗凋亡因子蛋白及下調(diào)促凋亡因子蛋白，抑制凋亡家族的活化，觸發(fā)應(yīng)激蛋白，從而起到保護(hù)腦組織神經(jīng)細(xì)胞的作用。

3 矢荅剌知丸對大鼠腦缺血再灌注后模型海馬區(qū)作用的影響

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，腦血管疾病后遺癥的發(fā)生主要與海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞因子的再生性障礙密不可分，尤其缺血性腦損傷后遺癥的發(fā)生更是與之息息相關(guān)。因此，受損的神經(jīng)細(xì)胞活化及再生神經(jīng)營養(yǎng)因子，抑制死亡因子發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要。項(xiàng)目組研究發(fā)現(xiàn)[14]，海馬區(qū)神經(jīng)生長因子(NDF)對腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)細(xì)胞有一定保護(hù)作用，作為神經(jīng)系統(tǒng)重要的活性物質(zhì)之一，NDF執(zhí)行促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育及再生等方面的作用[15，16]。矢荅剌知丸給藥后能上調(diào)大鼠腦缺血再灌注后海馬區(qū) NGF 陽性細(xì)胞的表達(dá)，尤其是海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞的表達(dá)明顯，并且能夠減少大鼠腦組織缺血后的壞死的面積[14]，充分說明失荅刺知丸能夠活化神經(jīng)營養(yǎng)因子，對腦組織神經(jīng)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

4 矢荅剌知丸對Notch 信號通路作用機(jī)制的影響

Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物中，是一種高度保守的細(xì)胞間信號通路[17]。通過與相鄰細(xì)胞間相互作用來共同參與細(xì)胞增殖、分化等多個過程，對組織、器官的分化和發(fā)育具有重要作用[17-19]。近年來，學(xué)者對Notch信號相關(guān)通路的研究較多，經(jīng)長期對矢荅剌知丸作用機(jī)制的研究，對其抗炎癥反應(yīng)及抗凋亡的作用機(jī)理已較明確，但矢荅剌知丸是否也作用于Notch信號通路，參與細(xì)胞的增值及分化，對腦缺血后神經(jīng)血管的修復(fù)起到一定的作用，有待研究。為此，近年來項(xiàng)目組專注于矢荅剌知丸對Notch信號通路的研究。研究初步發(fā)現(xiàn)[20-22]，矢荅剌知丸通過上調(diào)Notch信號通路上游的配體和受體Notch1、Jagged1及Notch4、Delta4蛋白的表達(dá)，作用于Notch信號通路使其發(fā)揮通過增值分化等作用促進(jìn)缺血再灌注后神經(jīng)血管的恢復(fù)的功能。研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)矢荅剌知丸灌胃后的大鼠腦缺血再灌注模型，矢荅剌知丸高劑量7天組大鼠存活率較高，神經(jīng)功能損傷評分也降低明顯。因此本項(xiàng)目組推斷作為Notch信號通路上游代表性的靶基因，Notch1、Jagged1及Notch4、Delta4的高表達(dá)可作為Notch信號通路激活進(jìn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的標(biāo)志。

為進(jìn)一步證實(shí)矢荅剌知丸可激活Notch信號通路，項(xiàng)目組將對Notch 信號通路中下游的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,b HLH)轉(zhuǎn)錄因子Hes家族進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，以此作為矢荅剌知丸激活Notch信號通路的補(bǔ)充證據(jù)。

5 小結(jié)和展望

綜上所述，矢荅剌知丸可通過參與抗炎癥反應(yīng)，抗凋亡的過程，促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)生長因子的高表達(dá)，促進(jìn)缺血再灌注后神經(jīng)血管的恢復(fù)，激活相關(guān)信號通路， 從而發(fā)揮對腦組織神經(jīng)的保護(hù)作用。目前，已證實(shí)矢荅剌知丸可上調(diào)Notch信號通路上游的相關(guān)配體和受體，激活Notch信號通路，促進(jìn)神經(jīng)血管的恢復(fù)。為進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論的可靠性，本項(xiàng)目組將繼續(xù)對Notch信號通路下游的相關(guān)靶基因進(jìn)行深一步的研究。且目前僅限于對矢荅剌知丸理論成果的研究，臨床實(shí)驗(yàn)的資料尚不完整，有待進(jìn)一步研究。