中草藥植物組織培養(yǎng)形成有效成份的技術(shù)方法

徐世鋒,王殿亭（執(zhí)筆人）

（1.甘肅省武威市涼州區(qū)羊下壩鎮(zhèn)人民政府農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，733000;2.甘肅省武威市涼州區(qū)古城鎮(zhèn)人民政府農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，733000;）

植物組織培養(yǎng)（Plant Tissue Culture）是應(yīng)用無菌培養(yǎng)的方法培養(yǎng)植物的一個離體部分，也即是一種將自然環(huán)境中分離出來的植物細胞或組織放入含有合成培養(yǎng)基的瓶中，在無菌條件下使之生長或發(fā)育的方法。運用組織培養(yǎng)方法可以在比較簡單易觀察的條件下研究細胞、組織或器官的繁殖、生長和分化，以及各種外界因素對它們的影響，從而為解決藥物生產(chǎn)中的某些問題開辟了廣闊的前景，目前已有若干重要成果應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中，一為營養(yǎng)繁殖系的快速繁殖。植物組織培養(yǎng)技術(shù)已成功用于中草藥研究中，如貝母繁殖率非常低，而用組織培養(yǎng)分化出的三個月左右的鱗莖，其大小就相當于用種子繁殖二年生的鱗莖，藥用植物的有效成分一般都從植物體提得，其產(chǎn)量和質(zhì)量難免要受到植物的遺傳性、生長條件、收獲時間及貯藏和運輸?shù)纫蛩厮绊?，如果能采用類似培養(yǎng)微生物產(chǎn)生抗菌素的方法生產(chǎn)有效成分，就可克服這些缺點，這對生長條件要求嚴格、生長緩慢、產(chǎn)量低、價值貴重的植物藥更有意義。因此，利用組織培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分，探索天然藥物生產(chǎn)工業(yè)化的途徑是當前藥物生產(chǎn)的一個新方向，隨著大規(guī)模人工培養(yǎng)技術(shù)的成功，就有可能用組織培養(yǎng)法來代替全植物提取有效成分，這項工作將是未來研究植物藥的核心。

1 培養(yǎng)基的組成和配制法

近年來用的化學合成培養(yǎng)基大致由糖類、多種無機鹽類、微量元素、氨基酸、酰胺、嘌呤、維生素、生長素成分組成。此外，有些培養(yǎng)基還可添加天然的汁液，如椰子汁、酵母提取液、水解酪蛋白、麥芽浸出液等，培養(yǎng)基中如加入0.5～1%的瓊脂即為靜止培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，否則為懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基。不同植物材料常需要改變配方，如維持生長和誘導細胞分裂和分化的培養(yǎng)基配方就不同，因此配方的種類很多，目前以Ms（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基配方為最常用的一種基本培養(yǎng)基，它利于一般植物組織和細胞的快速生長。總之，在進行組織培養(yǎng)研究時應(yīng)根據(jù)研究目的和培養(yǎng)植物的種類來確定培養(yǎng)基的組成，除營養(yǎng)、誘導作用外還應(yīng)當注意離子平衡和毒性問題，如水一般都采用重蒸餾水，無機鹽類一般都需用化學純的藥品，pH值可用1N KoH（或NaOH）溶液和2N HCI調(diào)整。有時可以用普通藥品代替，但須注意這些藥品不僅應(yīng)有營養(yǎng)價值，還須無毒。如果在工業(yè)上使用大缸深層培養(yǎng)細胞或組織生產(chǎn)有效成分和生物制品、應(yīng)用培養(yǎng)基的量將要以噸位計量時，則采用什么代用品較為經(jīng)濟實用更應(yīng)慎重考慮。

2 培養(yǎng)條件

2.1 溫度。對大多數(shù)植物組織20～28℃即可滿足生長所需，其中26～27℃最適合。

2.2 光。組織培養(yǎng)通常在散射光線下進行。光的影響可導致不同的結(jié)果。有些植物組織在暗處生長較好，而另一些植物組織在光亮處生長較好，但由愈傷組織分化成器官時，則每日必須要有一定時間的光照才能形成芽和根。有些次生物質(zhì)的形成，光是決定三因素。

2.3 滲透壓。滲透壓對植物組織的生長和分化很有關(guān)系。在培養(yǎng)基中添加食鹽、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物質(zhì)可以調(diào)整滲透壓。通常1～2個大氣壓可促進植物組織生長，2個大氣壓以上時，出現(xiàn)生長障礙，6個大氣壓時植物組織即無法生存。

2.4 酸堿度。一般植物組織生長的最適宜pH為5～6.5。在培養(yǎng)過程中pH可發(fā)生變化，加進磷酸氫鹽或二氫鹽，可起穩(wěn)定作用。

2.5 通氣。懸浮培養(yǎng)中細胞的旺盛生長必須有良好的通氣條件。小量懸浮培養(yǎng)時巨常轉(zhuǎn)動或振蕩，可起通氣和攪拌作用。大量培養(yǎng)中可采用專門的通氣和攪拌裝置。

3 材料和方法

從低等的藻類到苔蘚、蕨類、種子植物等高等植物的各類、各部分都可采用作為組織培養(yǎng)的材料，一般裸子植物多采用幼苗、芽、韌皮部細胞，被子植物采用胚、胚乳、子葉、幼苗、莖尖、根、莖、葉、花藥、花粉、子房和胚珠等各個部分。

由于植物在自然條件下，表面常被霉菌和細菌污染，故材料必須進行滅菌處理。一般用漂白粉溶液（1～10%）、次氯酸鈉溶液（0．5～10%）、升汞溶液（0.01%）、乙醇（70%）或過氧化氫（3～10%）等處理后，再用無菌水反復沖洗至凈，然后在無菌室內(nèi)，將所取的組織迅速培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上。在適宜的條件下，受傷組織切口表面不久即能長出一種脫分化的組織堆塊，稱為愈傷組織（Callus），此種愈傷組織在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上經(jīng)一定時間即能誘導生長成整株植物，因此愈傷組織既可是某種植物代謝產(chǎn)物的來源，又是誘導成株的主要途徑之一。

在適宜的培養(yǎng)條件下，還可使愈傷組織長期傳代生存下去，這種培養(yǎng)稱為繼代培養(yǎng)。但在繼代培養(yǎng)中，不少植物培養(yǎng)的組織或細胞隨著再培養(yǎng)代數(shù)的增加，分化能力就逐漸降低甚至喪失，其原因可能是由于在培養(yǎng)過程中原有母體中存在的、與器官形成有關(guān)的特殊物質(zhì)被逐漸消耗所致，因此可以用激素或改善營養(yǎng)條件使之恢復，也有認為是組織和細胞在長期培養(yǎng)中遺傳往的改變，主要是染色體的變化，出現(xiàn)大量多倍性或非整倍性細胞，這種改變恢復的可能住較小。不同的培養(yǎng)基可以使愈傷組織具有不同的生長速度，結(jié)構(gòu)也可松可緊，利用這些特性可使之分散成為單細胞或很小的細胞團。要形成單細胞培養(yǎng)宜在較高鹽分、高生長素及高水解酪蛋白的培養(yǎng)基中進行，然后移入液體并經(jīng)攪拌而分散成單細胞。也有用加入一些果膠酶的辦法，但一般來說要得到純一的單細胞是很少的。

在培養(yǎng)藥用植物選材時，還應(yīng)考慮到所需要的次生物質(zhì)在植物體中的合成部位，如果選材和培養(yǎng)方法適當，可使原植物內(nèi)所產(chǎn)主的代謝物通過細胞或組織培養(yǎng)發(fā)生生化轉(zhuǎn)變而獲得。

通過組織培養(yǎng)可獲得有效成分，但實際上只有大量培養(yǎng)成功才有經(jīng)濟價值。因此在生產(chǎn)上常采用懸浮培養(yǎng)法來代替含有瓊脂的固體培養(yǎng)基。愈傷組織懸浮培養(yǎng)的生長通常比靜止培養(yǎng)快，這是由于懸浮培養(yǎng)時營養(yǎng)成分可較快地滲入細胞，抑制生長的代謝廢物可較快地除去，同時供氧情況也較好，在進行這種培養(yǎng)時要注意通氣與定期更新營養(yǎng)液，這是保證生長穩(wěn)定，次生物質(zhì)產(chǎn)量高的關(guān)鍵之一。

4 有效成分的形成

利用組織培養(yǎng)方法產(chǎn)生藥用成分，已漸漸成為藥物生產(chǎn)的新方向之一。在通常應(yīng)用的基本培養(yǎng)基中適當添加生長激素、維生素或其他化學藥品有時能使代謝物增加，如白花曼陀羅組織培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基中加進0.1%酪氨酸可使阿托品的產(chǎn)量增加7倍多，蕓香組織培養(yǎng)時在培養(yǎng)基中添加4一羥基-2喹啉酚，可促進白蘚堿的合成和積累，在這兩例中的添加物被認為是生物合成的前體。又如培養(yǎng)三分三愈傷組織時，在生長后期供給1my/1激動素，可使東莨菪堿的含量達到0.495%，比原植物中的含量提高很多。

除了培養(yǎng)基的組成外，環(huán)境因素也影響次生物質(zhì)的產(chǎn)生。例如石芹的組織培養(yǎng)在黑暗中雖也增殖，但不形成黃酮類，而當暴露于光線中時，就能測出芹菜甙。組織培養(yǎng)應(yīng)用在藥學方面的工作雖然歷史不長，但發(fā)展很迅速，它具有如下一些優(yōu)點：

4.1 利用組織培養(yǎng)代替原植物的栽培以獲得所需的有效成分，達到產(chǎn)量高，成本低的目的，還可節(jié)約土地。

4.2 除了應(yīng)用于產(chǎn)生次生物質(zhì)外，還可應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化。例如煙草組織培養(yǎng)中蒂巴因去甲基后可能生成嗎啡。

4.3 從組織培養(yǎng)的定性分析中發(fā)現(xiàn)新化合物。例如在蕓香組織培養(yǎng)中，合成和積累了蕓香素（Rutacultin），它是一個至今尚未能從原植物或其他植物的呋喃香豆精中檢測到的化合物。因而，組織培養(yǎng)將是獲得新的生物活性化合物的一個來源。

4.4 一般情況下，組織培養(yǎng)是異養(yǎng)的，但也有自養(yǎng)的細胞系株，它們具有光合作用的能力而不依賴外界的糖類供應(yīng)。這種特性將使細胞培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)越于全植物，并更為經(jīng)濟。

目前中國有關(guān)單位已成功地將麥角菌、靈芝、猴頭菇等真菌進行工業(yè)化生產(chǎn)，高等植物組織培養(yǎng)在工業(yè)化中的應(yīng)用也正在研究?？傊?，植物組織培養(yǎng)這一新技術(shù)在中草藥方面應(yīng)用的前途是無限廣闊的，它不僅有利于探討和闡明藥用植物生理、遺傳和成分生物合成等一系列理論問題，而且一旦工業(yè)化生產(chǎn)問題得到解決，將可以為防病治病做出很大的貢獻。