蜂膠與楊樹膠鑒別

張翠平 黃帥 胡福良│文

浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州310058

蜂膠生產(chǎn)受膠源植物、蜂種、采膠方式、季節(jié)、氣候條件以及生產(chǎn)過程等多種因素的影響，產(chǎn)量相對有限。蜂膠原料的緊俏和利益的驅(qū)動，促使一些不法廠家用楊樹芽熬制出楊樹膠摻入到蜂膠中或直接以楊樹膠冒充蜂膠，并加入類黃酮類物質(zhì)，人為地提升總黃酮含量，達(dá)到以次充好的目的。蜂膠摻雜使假現(xiàn)象愈演愈烈，真蜂膠的價值難以體現(xiàn)，蜂農(nóng)、蜂膠加工企業(yè)及消費(fèi)者的權(quán)益難以保障。

楊屬（Populus）植物是楊屬型蜂膠的植物來源，近年來，蜂膠與楊樹膠鑒別研究成為蜂膠質(zhì)量控制研究的熱點(diǎn)。研究者嘗試通過液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法、紅外光譜法、熱分析法等現(xiàn)代分析分離技術(shù)以及蜂膠與楊樹膠的化學(xué)成分對比研究等多種方法來鑒別蜂膠與楊樹膠。本文對國內(nèi)外蜂膠與楊樹膠鑒別研究進(jìn)展按照鑒別方法及鑒別指標(biāo)作一介紹。

1 液相色譜法（HPLC）

液相色譜指紋圖譜近年在蜂膠與楊樹膠鑒別方面發(fā)揮了重要作用。周萍等（2009）測定了蜂膠、楊樹膠和摻假蜂膠的H PLC指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)蜂膠含有2個楊樹膠不含有的特征峰，楊樹膠中含有1個蜂膠中不含有的特征峰。他們對不同產(chǎn)地來源的62個蜂膠樣品建立H PLC指紋圖譜，將蜂膠圖譜分為6個區(qū)域，提出了以第四區(qū)的1號峰、2號峰、5號峰為蜂膠鑒別的主要依據(jù)，結(jié)合6個區(qū)域的指紋圖譜進(jìn)行真?zhèn)舞b別。李櫻紅等（2014）建立了區(qū)分蜂膠與楊樹膠的H PLC指紋圖譜，以對照模板為參照，通過《中藥指紋圖譜相似度計算軟件》計算，對蜂膠、楊樹膠、蜂膠中摻楊樹膠、蜂膠中摻外源性黃酮類化合物、既非蜂膠又非楊樹膠等樣品的相似度范圍進(jìn)行了限定。該方法可以鑒別出楊樹膠摻假量40% 以上的樣品。

潘建國等（2002）采用液相色譜法在蜂膠中檢測到10-羥基-2-癸烯酸（10-HDA），含量大約為0.22%。10-HDA是由蜜蜂上顎腺分泌的一種蜂王漿中所特有的高效生物活性物質(zhì)，蜜蜂有可能在采膠的過程中加入了該物質(zhì)。然而他們僅測定了3個樣本，是否所有蜂膠中都含有10-HDA，含量多少等都有待進(jìn)一步研究。盛文勝等（2008）用液相色譜法對蜂膠與楊樹膠中肉桂酸含量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)真假蜂膠中肉桂酸的含量存在差異。但是，由于不同地區(qū)采集的蜂膠即使同一成分含量差異也較大，對此還需要進(jìn)行大樣本研究才能確定其可行性。

張翠平等（2011）采用HPLC建立區(qū)分蜂膠與楊樹膠的指紋圖譜，8個不同地區(qū)蜂膠的H PLC指紋圖譜十分相似，與楊樹膠表現(xiàn)出不同的指紋圖譜特征。其中，蜂膠中2個共有峰是楊樹膠中沒有的特征指紋峰，而3個不同來源的楊樹膠中有3個共有峰是蜂膠中沒有的特征指紋峰，且這5個特征峰明顯，相互間沒有干擾，易鑒別。

王小平等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠與楊樹膠主要化學(xué)成分基本相同，只是相對含量有所不同，并建立了蜂膠指紋圖譜分析方法，確定有13個共有峰，其中4個成分為已知成分，而10批蜂膠中8號峰和10號共有峰的峰面積甚微，而在楊樹膠中這兩個峰均較高，認(rèn)為這兩個峰的明顯程度可以進(jìn)行蜂膠與楊樹膠的鑒別。但該方法樣本量小，需收集不同產(chǎn)地大量的樣品進(jìn)行系統(tǒng)研究。

劉莉敏等（2014）對9個國內(nèi)外蜂膠樣品75 %熱乙醇提取液用超高效液相色譜四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-Q-TOF-MS）進(jìn)行了一級陽離子化[M+H+]總離子流色譜（TIC）和總質(zhì)譜（色譜和質(zhì)譜指紋）的采集分析。從TIC指紋中發(fā)現(xiàn)，2個廣東成品蜂膠色譜指紋與其余7個極為不同，判斷為異常蜂膠；9個蜂膠樣品均未檢出蘆丁和槲皮素。總質(zhì)譜指紋主成分分析結(jié)果表明，2個異常蜂膠的判別與色譜指紋結(jié)果一致。由于色譜指紋圖譜以“整體性”和“模糊性”為特點(diǎn)，在沒有具體指標(biāo)成分參考條件下，在不同檢測條件下圖譜很難完全重復(fù)，這給方法的推廣應(yīng)用帶來困難。

張翠平等（2014）采用反相-高效液相色譜法（R P-HPLC）開發(fā)出了一種同時分析中國蜂膠12種黃酮類和8種酚酸類化合物的方法，并成功將其應(yīng)用于中國蜂膠的質(zhì)量控制。分析結(jié)果顯示，香草酸、蘆丁、楊梅酮和木犀草素在所有分析的蜂膠和樹膠樣本中均未被檢出；而咖啡酸、阿魏酸和p-香豆酸僅在蜂膠中檢出，而楊樹膠樣本中并未發(fā)現(xiàn)，提示這幾種化合物可作為區(qū)分蜂膠與楊樹膠的標(biāo)志性成分。此外，楊樹膠的黃酮類化合物圖譜同蜂膠相近，短葉松素、松屬素、3-O-乙酰基短葉松素、柯因和高良姜素是其中的主要成分。因此，此方法可將咖啡酸、阿魏酸和p-香豆酸用于區(qū)分蜂膠和楊樹膠的定性指標(biāo)，通過短葉松素、松屬素、3-O-乙?；倘~松素、柯因和高良姜素含量的多少，在一定程度上判斷中國蜂膠質(zhì)量的優(yōu)劣。

2 氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）

由于蜂膠中含有大量的揮發(fā)性成分，因此有關(guān)蜂膠與楊樹膠中揮發(fā)性成分的對比研究也較多。余蘭平等（2006）采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠中芳香酸、醇及酯類物質(zhì)的含量明顯高于楊樹膠，楊樹膠中總黃酮和萜烯類化合物的含量略高于蜂膠。蜂膠和楊樹膠中苯甲醇、3,4-二甲氧基肉桂酸、3-苯基-2,3-二甲基環(huán)丙烯、2,6-二羥基-4-甲氧基查耳酮和柯因的含量有比較大的差異，反油酸、1-(3-甲氧苯基)乙酮、4-乙?；蚕⑾闼岜交谆ブ辉诜淠z中存在，并且含量在1%以上，4-羥基-3-甲基苯乙酮和佛手油烯在楊樹膠中存在，而在蜂膠中不存在。

程煥等（2012）分別采用固相微萃取法（S P ME）、動態(tài)頂空（D H S）對蜂膠和楊樹膠揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（G C-MS）法結(jié)合計算機(jī)檢索對其揮發(fā)性成分進(jìn)行分析和鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蜂膠中的酯類物質(zhì)（乙酸-3-甲基-3-丁烯-1-醇酯、3-甲基-2-丁烯-1-醇甲酸酯、乙酸-3-甲基-3-丁烯-1-醇酯、3-甲基-2-丁烯酸-2-苯乙酯、壬酸乙酯、月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯）、醇類物質(zhì)（3-戊烯-2-醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇、α-桉葉醇）、萜烯類物質(zhì)（β-葎草烯、雪松烯）、烯烴類物質(zhì)八氫二甲基-2-(1-亞異丙基)萘在楊樹膠中均未檢測到。而楊樹膠中醇類物質(zhì)(+/-)-α-紅沒藥醇、烯烴類物質(zhì)α-姜黃烯2,6,6,9-四甲基-三環(huán)[5.4.0.0(2,8)]-9-十一烯也未在蜂膠中檢測到。

王向平等（2012）以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分別對蜂膠和楊樹膠的化學(xué)組分進(jìn)行了分離鑒定，蜂膠中共鑒定出75 種物質(zhì)，楊樹膠中共鑒定出71種化合物。蜂膠和楊樹膠中的2,6-二羥基-4-甲氧基查耳酮、高良姜素和柚木柯因的含量有明顯差異。3,4-二甲氧基肉桂酸、棕櫚酸、1-二十六烷醇、1-十九烯只在蜂膠中存在并且含量均高于2%，愈創(chuàng)木醇、1-甲基-4-(6-甲基-5-庚烯-2-基)苯、2-苯基苯并咪唑在楊樹膠中存在而在蜂膠中不存在。因此，可通過檢測愈創(chuàng)木醇、1-甲基-4-(6-甲基-5-庚烯-2-基)苯、2-苯基苯并咪唑是否存在于蜂膠中來鑒別蜂膠中是否摻入了楊樹膠，而通過檢測2,6-二羥基-4-甲氧基查耳酮、柚木柯因和高良姜素的含量來確定蜂膠的真?zhèn)魏蛽郊俪潭取?/p>

電子鼻是根據(jù)仿生學(xué)原理，由傳感器陣列和自動化模式識別系統(tǒng)所組成，是一種新穎的分析、識別和檢測復(fù)雜氣味和大多數(shù)揮發(fā)性成分的儀器，已經(jīng)用于食品的等級劃分與新鮮度檢測。延莎等（2012）用電子鼻對來自中國17個省份的71個蜂膠樣品及其楊樹膠進(jìn)行測定，通過主成分分析，可以較好地區(qū)分蜂膠和楊樹膠。董捷等（2008）利用電子鼻對中國14個省市及摻假蜂膠共52個樣品進(jìn)行分析，通過電子鼻對蜂膠芳香特征的響應(yīng)實(shí)驗(yàn)，可以得出電子鼻對蜂膠的芳香成分有明顯的響應(yīng)，并且每一個傳感器對蜂膠的響應(yīng)各不相同。應(yīng)用電子鼻的幾類傳感器，針對幾類特定的物質(zhì)（而不是幾種物質(zhì)）進(jìn)行分析，并對所得的結(jié)果應(yīng)用主成分分析方法（P C A）進(jìn)行處理，能夠鑒別摻假蜂膠。但在該實(shí)驗(yàn)中，也存在幾個地區(qū)的蜂膠樣品難以區(qū)分的情況。因此，對于利用電子鼻鑒別真假蜂膠技術(shù)還有待進(jìn)一步深入研究和完善。

延莎等（2012）采用氣質(zhì)與嗅聞儀結(jié)合的方法，分析了3種蜂膠樣品和楊樹膠的氣味活性成分，共鑒別出48 種氣味活性成分，包括酯類、醛類、醇類和酸類化合物。結(jié)果表明，形成蜂膠的氣味活性成分中具有更多的花香、果香物質(zhì)，如梨醇酯、糠醛、苯甲醛等化合物，使蜂膠具有更為清香、柔和的總體氣味特征，而楊樹膠呈現(xiàn)出的整體氣味較蜂膠更為刺鼻、尖酸，可以考慮從氣味特征上對蜂膠與楊樹膠進(jìn)行識別。

由于不同來源的蜂膠中揮發(fā)性成分差異較大，至今還未形成有效的基于蜂膠中揮發(fā)性成分的蜂膠與楊樹膠鑒別的標(biāo)準(zhǔn)方法。

3 紅外光譜法（IR）

由于紅外光譜圖具有整體性、特征性和模糊性的特點(diǎn)，可以作為復(fù)雜混合體系鑒別與質(zhì)量監(jiān)控的快速、有效的方法，因此紅外光譜法是應(yīng)用于蜂膠真?zhèn)舞b別較為可行的一種技術(shù)，但其實(shí)驗(yàn)結(jié)果受樣品處理的影響容易產(chǎn)生假象。

Wu等（2008）使用傅里葉變換紅外光譜和二維紅外光譜聯(lián)用對不同地區(qū)蜂膠及楊樹芽分泌物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們之間具有相似的紅外譜圖，二者的差異在于長鏈烴基化合物的不同（包括長鏈烷烴、長鏈烷基酯和長鏈烷基醇）。蜂膠提取物比楊樹芽提取物中長鏈烷基類化合物更多，這些化合物中碳原子呈Z形排列，而楊樹芽提取物中是不規(guī)則的。龔上佶（2011）研究發(fā)現(xiàn)，樹膠與蜂膠的光譜圖差異顯著。所有蜂膠在基團(tuán)頻率區(qū)存在兩個特征峰區(qū)域，分別是2848.53～2849.08和2916.76～2917.74（為烷烴的特征峰），而樹膠在這兩個區(qū)域不存在特征峰；楊樹膠特征峰集中在1150～1300（為醇、酚及醋類的特征峰）和1550～l650（為亞硝基、酞胺及烯烴的特征峰）兩個區(qū)域，而蜂膠在1800～4650間存在很多特征峰。這兩方面的差異可用于區(qū)別蜂膠與樹膠。X u等（2013）利用傅里葉變換近紅外光譜法（FT-NIR）對中國蜂膠中摻入楊樹膠進(jìn)行檢測。首先針對樹膠摻假建立了偏最小二乘數(shù)學(xué)模型，并采用偏最小二乘回歸方程對樹膠含量進(jìn)行定量分析，其結(jié)果也證實(shí)，采用FTNIR光譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法可以對中國蜂膠中樹膠摻假進(jìn)行快速檢測。

4 熱分析法（TA）

熱分析法是在程序控制溫度下，準(zhǔn)確記錄物質(zhì)理化性質(zhì)隨溫度變化的關(guān)系。付陽等（2006）采用熱分析法對蜂膠和楊樹膠的DSC-T G曲線的特征區(qū)間進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T G曲線分為兩個階段：100～300度為第一階段，是小分子的分解，蜂膠的失重率為47.72%，楊樹膠的失重率為32.69%；340～700度為第二階段，為大分子的降解，蜂膠的失重率為47.29%，楊樹膠的失重率為54.86%。而DSC曲線中，蜂膠在333.0度有一個吸收峰，在503.0度有一個放熱峰。楊樹膠在314度有一個吸收峰，在478.0度有一個放熱峰。通過比較發(fā)現(xiàn)，在第一失重階段，蜂膠的小分子有機(jī)物含量比楊樹膠高15%，而第二階段，蜂膠的失重較為緩慢，為黃酮類混合物的降解，楊樹膠具有典型的高分子聚合物的特征。從兩者的殘?zhí)悸蕘砜?，蜂膠幾乎為零，楊樹膠為7.48%。但該方法并未形成有效的檢測方法得以應(yīng)用。

5 薄層色譜法（TLC）

薄層色譜法是將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層，待點(diǎn)樣、展開后，根據(jù)比移值與適宜的對照物按同法所得的色譜圖的比移值作對比，用以進(jìn)行鑒別的方法。Tang等（2014）采用薄層色譜法來區(qū)分蜂膠和楊樹膠。結(jié)果表明，采用相似度、分層群聚、k-means聚類、神經(jīng)式網(wǎng)絡(luò)、 支持向量機(jī)等分析手段，能夠?qū)⒎淠z與楊樹膠區(qū)分開。

6 以葉綠素為指標(biāo)

找尋蜂膠與楊樹膠明確的差異成分用以二者的鑒別，是研究者最感興趣的，也是最理想的鑒別方法。

周立東等（2007）利用光譜法對比蜂膠與楊樹葉、楊樹芽中葉綠素含量的差別，發(fā)現(xiàn)測定的11個蜂膠樣品中均不含葉綠素，楊樹葉提取物中葉綠素含量較高，楊樹芽50%乙醇提取物中含有葉綠素，但含量較低，楊樹芽95%乙醇提取物中未能檢出葉綠素，楊樹膠中也未檢測到葉綠素。該方法可以鑒別直接摻入楊樹葉或楊樹芽粉末的假蜂膠，以及各種含葉綠素雜質(zhì)的摻假蜂膠，但不能排除其中摻有楊樹芽高極性溶劑提取物的可能。

楊茂森等（2012）根據(jù)相似相溶原理，利用極性較低有機(jī)溶劑對蜂膠及楊樹（芽）膠中葉綠素類物質(zhì)進(jìn)行溶解、分離萃取，通過分光光度法進(jìn)行定量對比檢測，發(fā)現(xiàn)蜂膠中葉綠素平均含量為6.73 m g/100 g，提純楊樹（芽）膠中葉綠素平均含量為111.2 mg/ l00 g，兩種不同膠體葉綠素含量差異十分明顯；在蜂膠中按不同比例摻入楊樹（芽）膠進(jìn)行回收檢測試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)楊樹（芽）膠摻入量與葉綠素的增加量呈線性關(guān)系。

7 以水楊苷和鄰苯二酚為指標(biāo)

楊屬植物的特征性成分是酚苷，以水楊苷、柳皮苷、2’-苯甲酸水楊苷和特里楊苷含量較為豐富。國內(nèi)外有關(guān)蜂膠化學(xué)成分的研究很多，從蜂膠中分離鑒定出了500多種成分，但迄今為止尚未有蜂膠中存在任何酚苷的報道，而很多研究曾報道過蜂膠中含有水楊酸及乙酰水楊酸等衍生物。楊屬植物中發(fā)現(xiàn)的酚苷均以β-葡萄糖苷形式連接，β-葡萄糖苷酶可催化水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-糖苷鍵，同時釋放出配基與葡萄糖體。張翠平等（2011）首次在新鮮蜂膠的酶提取液中檢測到β-葡萄糖苷酶活力，并證實(shí)該酶能夠水解芳香基β-D-葡萄糖苷，與Pontoh等（2002）從西方蜜蜂體內(nèi)分離純化得到的β-葡萄糖苷酶性質(zhì)相符。因此，推測蜜蜂在采集蜂膠以及蜂巢內(nèi)傳遞蜂膠的過程中已將酚苷水解。

楊屬植物有100多種，主要分布在溫帶和亞熱帶地區(qū)。水楊苷是酚苷的基本結(jié)構(gòu)單元，是更高級的水楊酸鹽類衍生物的主要降解產(chǎn)物之一，在所有研究過的楊屬植物的皮、葉、花，芽中均有分布。張翠平等（2011）用高效液相色譜法優(yōu)化了楊樹芽中水楊苷的測定方法，在蜂場周圍分布較多的北京楊和加拿大白楊的葉子和芽中均檢測到水楊苷存在；在隨機(jī)購買的11個楊樹膠樣本中也均檢測到水楊苷的存在；而在蜜蜂采集回蜂箱內(nèi)5 d、10 d、15 d、20 d 及30 d 的蜂膠樣本中均未檢測到水楊苷的存在。以上事實(shí)支持蜜蜂在采集加工蜂膠過程中已將水楊苷水解，而在楊樹膠制作過程中水楊苷穩(wěn)定存在，證明了以水楊苷為參照鑒別蜂膠與楊樹膠的可行性。除了水楊苷特征峰，還有一個未知成分（峰A）在所有楊樹膠樣本中存在，而在蜂膠中不存在，該未知成分經(jīng)黃帥等（2014）分離鑒定為鄰苯二酚。它在所研究的楊屬植物的芽、葉、花、皮中均有分布，其物理性質(zhì)極其穩(wěn)定，可在甲醇、酸性、堿性以及中性介質(zhì)中均能穩(wěn)定存在。在存在多酚氧化酶的條件下，鄰苯二酚可被氧化為1,2-苯醌，但其所需的氧化酶應(yīng)具有較強(qiáng)的特異性，即可以氧化具有鄰位二羥基的多酚類化合物。黃帥等（2014）首次在蜂膠中檢測到了多酚氧化酶的活性，并且證明了蜂膠中的多酚氧化酶來源于膠源植物，并非蜜蜂自身腺體所分泌。該酶天然狀態(tài)下處于未激活狀態(tài)，在蜜蜂采集加工蜂膠時，破壞植物組織后才能將其激活，從而使楊樹芽中的鄰苯二酚化合物氧化為鄰苯二醌，消失于蜂膠中。隨后，通過對國內(nèi)外大量蜂膠樣本的檢測驗(yàn)證，證實(shí)了以水楊苷和鄰苯二酚為指標(biāo)鑒別蜂膠與楊樹膠的方法是完全可行的。以水楊苷和A蜂（CCP）為指標(biāo)的蜂膠中楊樹膠的鑒別方法于2012年7月9日批準(zhǔn)為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（G H/T1081-2012），以水楊苷和鄰苯二酚為指標(biāo)的蜂膠中楊樹膠的鑒別方法于2017年11月1日批準(zhǔn)為國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T34782 -2017），成為法定的蜂膠與楊樹膠的鑒別方法。