蜜蜂腦部多巴胺神經(jīng)通路研究進(jìn)展

黃景南 張曌楠 和靜芳 李志國 朱雅楠 余岢駿 蘇松坤

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

引言

20世紀(jì)中葉開始，神經(jīng)系統(tǒng)的研究地位從以往生物與心理學(xué)研究的邊緣迅速躍升，成為神經(jīng)科學(xué)這一交叉學(xué)科。這一新興的學(xué)科促使生物化學(xué)、精神病學(xué)、解剖學(xué)、神經(jīng)病學(xué)、心理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生理學(xué)等不同研究背景的科研工作者開始合作，探索腦科學(xué)的奧秘[1]。微電極發(fā)明雖然可以記錄單個(gè)細(xì)胞的電活動(dòng)，但是很難甄別其生物化學(xué)特性。20世紀(jì)60年代中期，F(xiàn)alck-Hillarp熒光顯微鏡技術(shù)可以選擇性觀察兒茶酚胺以及5-羥色胺能神經(jīng)元。這些胺類通路的研究又很快使得神經(jīng)遞質(zhì)研究突破了對整個(gè)腦組織勻漿的局限性。20世紀(jì)70年代開始神經(jīng)遞質(zhì)受體的生化研究、神經(jīng)多肽免疫組化和位點(diǎn)的放射自顯影研究，更是進(jìn)一步促進(jìn)了神經(jīng)生理學(xué)家、神經(jīng)解剖學(xué)家、神經(jīng)化學(xué)家和神經(jīng)藥理學(xué)家們的對話。而過去兩個(gè)世紀(jì)以來，分子生物學(xué)技術(shù)手段的應(yīng)用更加豐富了這一交流。故可以說神經(jīng)科學(xué)是一門整合性最強(qiáng)的科學(xué)學(xué)科，在蜜蜂領(lǐng)域亦是如此。

蜜蜂(Apis)是一種具有復(fù)雜行為的社會(huì)性昆蟲[2]。蜜蜂的中樞神經(jīng)系統(tǒng)是其正常信息處理的物質(zhì)基礎(chǔ)，而神經(jīng)遞質(zhì)與蜜蜂復(fù)雜的社會(huì)行為有著非常緊密的關(guān)系。蜜蜂的大腦僅有約950,000個(gè)神經(jīng)元，約1 mm3大小[3]，但其腦部神經(jīng)遞質(zhì)卻被廣泛研究。正是因?yàn)槊鄯浯竽X遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其它物種的大腦，并且意大利蜜蜂作為已經(jīng)被測序的模式生物，所以它成為很多杰出生物科學(xué)家研究神經(jīng)生物學(xué)的理想材料，蜜蜂腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)是一類具有生物活性的物質(zhì)，在調(diào)控神經(jīng)元信號傳遞、神經(jīng)回路和生理功能中發(fā)揮極其重要的作用，并能參與調(diào)節(jié)視覺、晝夜節(jié)律、采集運(yùn)動(dòng)、生長發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶等神經(jīng)活動(dòng)[4,5]。

除酪胺和章魚胺研究較多外，在蜜蜂中備受關(guān)注的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)主要為兒茶酚胺類和吲哚胺類兩種，其中兒茶酚胺類主要有多巴胺(dopamine)、去甲腎上腺素(norepinephrine)、腎上腺素(epinephrine)、左旋多巴(levodopa)和3,4-二羥苯乙酸(3,4-Dihydroxyphenylacetic acid)；吲哚胺類主要有5-羥色胺(serotonin)、5-羥-3-吲哚乙酸(5-Hydroxyindoleacetic acid)。多巴胺的直接前體物質(zhì)為左旋多巴，由酪氨酸(tyrosine)經(jīng)酪氨酸羥化酶代謝合成，多巴胺在特定酶的作用下經(jīng)不同的代謝途徑可生成3,4-二羥苯乙酸和去甲腎上腺素兩種產(chǎn)物，并最終代謝為高香草酸，應(yīng)用伏安法或者高效液相電化學(xué)檢測法易于檢測。在不同行為或者發(fā)育階段，蜜蜂腦部生物胺類神經(jīng)遞質(zhì)的種類和含量有著極為不同的變化，表明生物胺神經(jīng)遞質(zhì)與蜜蜂行為有著密切聯(lián)系。本文對多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)在蜜蜂中的研究情況進(jìn)行綜述，以期為研究調(diào)控蜜蜂行為的神經(jīng)分子機(jī)制的學(xué)者提供借鑒，特別是對蜜蜂舞蹈行為（雖然舞蹈行為的發(fā)現(xiàn)早在100多年以前），但是在真正意義上對蜜蜂舞蹈行為在分子神經(jīng)科學(xué)上的完全闡明以及蜜蜂之間如何有效溝通還有待進(jìn)一步更深入的研究。

1 蜜蜂腦部

蜜蜂的腦由前腦、中腦和后腦3部分組成，前腦構(gòu)成腦的主要部分，前腦頂端著生3只單眼，中央有1對蕈形體（蘑菇體，mushroom bodies），主要功能是接收觸角葉(antennal lobes)和視葉(optic lobes)的神經(jīng)投射，在求偶調(diào)節(jié)、嗅覺辨別和視覺學(xué)習(xí)等方面扮演重要角色；前腦兩側(cè)膨大的2個(gè)大型的視葉是視覺功能的神經(jīng)中心，視葉兩側(cè)各著生著復(fù)眼。主要由嗅葉組成的中腦位于前腦的后方，由其發(fā)出的1對神經(jīng)分布到觸角，是觸覺的神經(jīng)中樞。后腦較之其它部分不發(fā)達(dá)，由之發(fā)出的神經(jīng)通至上唇和前腸。蜜蜂的神經(jīng)系統(tǒng)包含主干神經(jīng)中樞、腹部的神經(jīng)弦和食管下的神經(jīng)中樞。工蜂腦中一半以上屬于視葉，約有851,458個(gè)神經(jīng)細(xì)胞[6]。

2 蜜蜂腦部多巴胺影響生命活動(dòng)

多巴胺與亢奮和歡愉的信息傳遞有關(guān)，能調(diào)節(jié)高等動(dòng)物大腦的情感認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶、軀體運(yùn)動(dòng)等行為活動(dòng)[7]。多巴胺作為蜜蜂腦內(nèi)一種非常重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，在蜜蜂復(fù)雜的社會(huì)行為方面受到了研究者的廣泛關(guān)注。蜜蜂腦部生物胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的改變可能直接影響其行為[8-11]，不同的行為活動(dòng)也會(huì)使多巴胺的含量發(fā)生變化。研究表明，多巴胺的直接前體左旋多巴在脫羧酶的作用下，可以生成多巴胺，多巴胺合成后儲(chǔ)存在囊泡中。受到刺激后的多巴胺能神經(jīng)元釋放多巴胺到突觸間隙，并與后膜的受體結(jié)合。產(chǎn)生作用后很大部分的多巴胺被突觸前膜重?cái)z取，有一部分可被多巴胺囊泡攝取再次使用，一部分則被代謝分解，極少部分的多巴胺在突觸間隙內(nèi)被分解或者被突觸后膜吸收。多巴胺的再攝取需要多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transporter, DAT)的參與。

目前，在不同蜂種、不同行為狀態(tài)蜜蜂體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量及代謝物的研究均取得了一定進(jìn)展。多巴胺現(xiàn)已被證實(shí)參與蜜蜂日常行為、運(yùn)動(dòng)、記憶、繁殖等活動(dòng)[12,13]，在穩(wěn)定蜂群的社會(huì)構(gòu)成、蜂群失王條件下雌性個(gè)體生殖生理變化、哺育、采集、舞蹈語言、防御和勞動(dòng)分工等方面具有重要意義。通過注射多巴胺受體(dopamine receptor)拮抗劑，觀察蜜蜂的伸刺反應(yīng)，研究蜜蜂的懲罰性學(xué)習(xí)，發(fā)現(xiàn)注射多巴胺受體拮抗劑的蜜蜂不會(huì)進(jìn)行懲罰性學(xué)習(xí)。不同行為狀態(tài)蜜蜂間比較發(fā)現(xiàn)采集蜂的多巴胺含量高于哺育蜂，老齡蜜蜂比年輕蜜蜂有更高的多巴胺含量[8,14]，表明多巴胺可能與勞動(dòng)分工有關(guān)。多巴胺可能調(diào)控雌性蜜蜂繁殖的作用已經(jīng)被證實(shí)，當(dāng)工蜂被飼喂多巴胺或者多巴胺前體物質(zhì)后，工蜂的卵巢會(huì)開始發(fā)育[10,15]。在無王群中，隨著失王時(shí)間的延長，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，工蜂腦部多巴胺含量升高，同時(shí)卵巢也隨之發(fā)育。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)蜂王信息素能降低蜜蜂的大腦多巴胺含量，多巴胺水平的測量顯示，來自有王群的工蜂的多巴胺含量比來自無王群的工蜂的多巴胺含量低，但在不同的年齡之間沒有顯著差異[16]。這也證明了工蜂較低的多巴胺含量使蜂王能夠控制工蜂的行為，使蜂王能夠在蜂群中扮演自己的角色和鞏固自己的地位。神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺和下游產(chǎn)物去甲腎上腺素含量與卵巢發(fā)育呈正相關(guān)，卵巢發(fā)育越完善，多巴胺和NE含量越高[17]。多巴胺不僅和雌性蜜蜂的生殖發(fā)育有關(guān)，發(fā)現(xiàn)在雄蜂性成熟過程中也發(fā)揮重要作用，伴隨著雄性器官的發(fā)育，雄蜂腦部的多巴胺含量隨之增加，在婚飛前達(dá)到峰值[18]，對雄蜂注射多巴胺后，雄蜂的交尾飛行活動(dòng)會(huì)顯著增加[19]。另外，處女王的多巴胺含量比那些低攻擊性的已交尾蜂王要高，不僅說明多巴胺可能會(huì)促進(jìn)處蜂王的戰(zhàn)斗和侵略行為[20]，也表明多巴胺和交尾活動(dòng)有關(guān)。

蜜蜂從幼蟲到蛹的發(fā)育過程中，多種生物胺含量漸漸上升，在成年蜂中，腦部多巴胺含量隨著日齡的增多而增加，在采集蜂中多巴胺含量則處于較高濃度，相同日齡的蜜蜂中勞動(dòng)分工也不太一樣。同日齡不同工作的采集蜂體內(nèi)生物胺也有差異，蜜蜂采集歸巢的跳舞蜂多巴胺含量總是高于伴隨蜂，向蜜蜂腹部注射多巴胺受體拮抗劑后，蜜蜂活躍性下降，注射多巴胺受體激動(dòng)劑后活躍性增加[21]，而且經(jīng)多巴胺拮抗劑處理后，出巢尋找蜜粉源的偵察蜂減少[22]，表明多巴胺可能與蜜蜂采集行為有關(guān)，也可能和舞蹈語言有關(guān)。給蜂群飼喂多巴胺的前體物質(zhì)左旋多巴后跳舞蜂數(shù)量增加[23]，表明多巴胺可能參與調(diào)節(jié)蜜蜂舞蹈行為的神經(jīng)活動(dòng)。不僅蜜蜂自身的發(fā)育和勞動(dòng)分工影響多巴胺的含量，不同食物也影響多巴胺的含量，工蜂和蜂王多巴胺的差異也可能是由于蜂王長期食用蜂王漿引起的，給蜜蜂飼喂酪氨酸和蜂王漿后，4日齡和8日齡工蜂腦部的多巴胺和代謝物顯著升高[24]，同時(shí)巢外活動(dòng)被抑制，由于蜂王漿中含有酪氨酸物質(zhì)，所以腦部多巴胺差異可以由食物來源引起，這可能也是蜂王腦部多巴胺含量高于工蜂的原因。對蜜蜂行為的分子分析揭示了許多關(guān)鍵分子的參與，這些觀察結(jié)果表明，多巴胺是調(diào)節(jié)蜜蜂行為的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)。

3 蜜蜂腦部多巴胺受體

脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物都有2種不同的多巴胺受體，廣泛分布于多巴胺神經(jīng)元的細(xì)胞膜、軸突、樹突，當(dāng)D1型受體被激活時(shí)，多巴胺受體會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平，而D2型多巴胺受體則會(huì)導(dǎo)致cAMP水平的降低，多巴胺生理功能是通過受體介導(dǎo)完成的[25]，在蜜蜂中，分子克隆技術(shù)已被用于識別兩種蜜蜂基因編碼多巴胺受體的同源性。目前有3種不同的多巴胺受體已被成功克隆，每個(gè)受體都有一個(gè)獨(dú)特的表達(dá)模式，并且每個(gè)受體在成年工蜂的腦部都有表達(dá)，其中AmDOP1和AmDOP2為D1型受體可以激活腺苷酸環(huán)化酶，使環(huán)腺苷酸增加，AmDOP3為D2型受體，則起相反作用。此外，AmDOP2不僅通過環(huán)腺苷酸通路起作用，還與蜜蜂OA受體AmOA1共同利用鈣離子通道起作用[26]。

利用細(xì)胞培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)，蛻皮激素和保幼激素水平對Amdop1、Amdop2、Amdop3的轉(zhuǎn)錄水平有顯著影響，在保幼激素處理的蜜蜂的蘑菇體中，多巴胺受體基因Amdop1的表達(dá)水平明顯降低[27]。用RNA干擾技術(shù)阻斷D1型受體基因AmDOP2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)蜜蜂行走時(shí)間減少，停止和梳毛時(shí)間增多，說明多巴胺通過特定受體發(fā)揮作用[28]，多巴胺受體可能直接或者間接影響完整信號通路的信息傳遞，從而調(diào)控運(yùn)動(dòng)行為。蜜蜂被注射多巴胺受體拮抗劑后，多巴胺作用過程被阻斷，蜜蜂終止懲罰性學(xué)習(xí)行為，但蜜蜂的獎(jiǎng)勵(lì)性學(xué)習(xí)行為能力增強(qiáng)[29]。

在關(guān)于蜜蜂的大腦藥理學(xué)研究中，廣譜型受體拮抗劑主要有三氟噻噸(flupenthixol)、螺哌隆(spiperone)、SCH23390，這些藥物可通過競爭結(jié)合位點(diǎn)的方式影響多巴胺與受體之間的神經(jīng)通路。不同藥物作用于不同類型的受體，放射配體3H-SCH23390和3H-spiperone分別識別D1和D2型受體，選擇特異性阻斷某一受體的拮抗劑可以研究不同的神經(jīng)通路。將三氟噻噸注射到1日齡的處女王的腹部，觀察到多巴胺信號封鎖程度升高，可以降低處女王打斗和蜇刺反應(yīng)，并降低戰(zhàn)斗的獲勝率[20]。對剛出房的蜜蜂到正常采集的不同日齡蜜蜂腦部進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)多巴胺受體基因Amdop1、Amdop2和Amdop3在整個(gè)大腦的表達(dá)與日齡變化相關(guān)。

4 蜜蜂腦部多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體

多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體存在于多巴胺能神經(jīng)元末梢，這個(gè)蛋白位于多巴胺神經(jīng)元突觸前膜中，具有重獲取多巴胺的生理效應(yīng)，常常作為成癮藥物的作用靶點(diǎn)之一。當(dāng)多巴胺能神經(jīng)元末梢接受到刺激信號時(shí)，多巴胺由突觸前膜的囊泡中被釋放到突觸間隙并作用于突觸后膜的受體后，DAT就變得活躍并很快將多巴胺再攝取，所以DAT能調(diào)控突觸間隙中多巴胺的有效濃度，使多巴胺對突觸前和突觸后受體進(jìn)行時(shí)間依賴性的激動(dòng)[30]。DAT基因敲除的小鼠不能重新獲取多巴胺從而滯留在突觸間隙，動(dòng)物不再呈現(xiàn)活動(dòng)亢奮，也使D1和D2受體mRNA下調(diào)，相反，多巴胺的釋放量也會(huì)調(diào)節(jié)DAT的活性。在蜜蜂中，轉(zhuǎn)運(yùn)體基因Amdat表達(dá)水平可以反映多巴胺能神經(jīng)元的活動(dòng)，通過逆轉(zhuǎn)錄的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)來測定蜜蜂腦部的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)工蜂從內(nèi)勤蜂轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀正g為基礎(chǔ)的采集行為，腦部的轉(zhuǎn)錄水平也會(huì)隨著日齡的增長而增加，與同齡的內(nèi)勤蜂相比，早熟的采集蜂的表達(dá)水平要高得多，這表明，這種表達(dá)方式與任務(wù)轉(zhuǎn)移有關(guān)；在雄蜂中，隨著日齡的增加，基因表達(dá)量也增加；對于蜂王，在交尾之后，Amdat的表達(dá)水平下降了，認(rèn)為可能是多巴胺能神經(jīng)元活動(dòng)增強(qiáng)刺激蜂王交尾，并在交尾后復(fù)原[31]，也驗(yàn)證了多巴胺神經(jīng)通路活動(dòng)與蜜蜂的行為活動(dòng)有關(guān)。

5 展望

探索腦的奧秘是自然界最誘人的科學(xué)問題之一。神經(jīng)科學(xué)是研究動(dòng)物和人類神經(jīng)系統(tǒng)與腦的結(jié)構(gòu)和功能的科學(xué)，是研究行為、心理活動(dòng)乃至智能以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病如何產(chǎn)生的科學(xué)。神經(jīng)科學(xué)由于其研究對象的復(fù)雜性，一開始就是高度跨學(xué)科的綜合學(xué)科，它得到了神經(jīng)生理學(xué)家、神經(jīng)解剖學(xué)家、神經(jīng)化學(xué)家、神經(jīng)藥理學(xué)家、心理學(xué)家、醫(yī)學(xué)家乃至工程科學(xué)家們的重視和參與。

多巴胺神經(jīng)元在工蜂、雄蜂和蜂王的整個(gè)發(fā)育過程中會(huì)發(fā)生改變，蜜蜂多巴胺神經(jīng)通路的深入研究對我們更深入了解蜜蜂的行為生殖發(fā)育、生命節(jié)律、生活特性等方面都是十分有意義的。多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體是特異性位于多巴胺神經(jīng)元的蛋白，可以研究多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)錄和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分布，更加深入探討多巴胺能神經(jīng)元的功能。目前，對蜜蜂多巴胺的研究還有很廣闊的空間，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究和開發(fā)的深入，可以用組織透明化抗體標(biāo)定技術(shù)研究多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體的分布，原位雜交對相關(guān)基因定位乃至多巴胺小分子定位定量，多巴胺受體和轉(zhuǎn)運(yùn)體微觀的化學(xué)結(jié)構(gòu)，多個(gè)層次的研究相結(jié)合，進(jìn)一步探討和研究蜜蜂行為與多巴胺之間的相互關(guān)系以及蜜蜂舞蹈行為的分子調(diào)控機(jī)制，最后對蜜蜂的大腦功能進(jìn)行描述，以期最終闡明蜜蜂腦功能如何控制其行為的發(fā)生與發(fā)展。

對于揭示神經(jīng)遞質(zhì)之間的互作關(guān)系以及神經(jīng)遞質(zhì)與行為之間的關(guān)系，進(jìn)而對大腦功能分區(qū)和基因功能定位，就變得異常重要。運(yùn)用CRISPR-Cas 9技術(shù)對蜜蜂基因組的多巴胺神經(jīng)通路的關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除，不僅可以在分子層面研究目標(biāo)基因的功能與作用通路，還可以闡明目標(biāo)基因與蜜蜂行為之間的調(diào)控機(jī)制，諸多奧秘還有待于更深入的研究和揭示。

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