豬痢疾發(fā)病機(jī)理及診斷技術(shù)研究進(jìn)展

Burrough ER 劉河冰譯

（北京維德維康生物技術(shù)有限公司，北京 100095）

豬痢疾最常發(fā)生于8～26周齡，以黏液出血性腹瀉為主要臨床癥狀。在斷奶仔豬中，發(fā)病率和死亡率分別為90%和30%。由于飼料消耗成本、治療用藥成本和死亡率的影響，受感染豬場(chǎng)往往發(fā)生嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬痢疾自1921年被Whiting等首次報(bào)道，目前在全世界范圍內(nèi)都有發(fā)生。

1 病原學(xué)

早在20世紀(jì)20年代，就有文獻(xiàn)報(bào)道臨床豬痢疾能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下重現(xiàn)。人們通過(guò)飼喂患病豬腸道內(nèi)容物成功重現(xiàn)豬痢疾病癥，但是多年來(lái)該病的確切病因一直成謎。早期的病理學(xué)研究中，豬痢疾的病變與精細(xì)螺旋體、彎曲菌以及纖毛蟲原生動(dòng)物導(dǎo)致的病變極其相似，尤其是結(jié)腸彎曲菌一直被認(rèn)為是該病的病原體。不過(guò)，隨后的幾篇研究報(bào)道否定了這種結(jié)論。研究者僅使用結(jié)腸彎曲菌飼喂無(wú)菌豬和普通豬，但結(jié)果并未引起豬痢疾病癥的出現(xiàn)。直到20世紀(jì)70年代，2個(gè)科研團(tuán)隊(duì)分別報(bào)道了螺旋體能夠?qū)е仑i痢疾的產(chǎn)生。這種新發(fā)現(xiàn)的螺旋體起初被命名為豬痢疾密螺旋體（Treponema hyodysenteriae），并被劃分到蛇形屬，直到最近才被重新劃分為短螺旋體屬。豬痢疾短螺旋體（Brachyspira hyodysenteriae）是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性菌，菌體長(zhǎng) 6～8 μm，寬 0.32～0.38 μm，每個(gè)菌體含有14～18個(gè)鞭毛。

目前除了豬痢疾短螺旋體外，還有2種新發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)溶血性致病短螺旋菌屬種，分別命名為Brachyspira suanatina和Brachyspira hampsonii，它們都能導(dǎo)致嚴(yán)重的黏膜出血性腹瀉。Brachyspira hampsonii在美國(guó)和加拿大首次被報(bào)道，并廣泛傳播，隨后在歐洲以及加拿大北極地區(qū)的豬只中有大量暴發(fā)。通過(guò)多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)對(duì)全球的Brachyspira hampsonii進(jìn)行遺傳學(xué)分析，結(jié)果顯示Brachyspira hampsonii有4種不同的基因進(jìn)化分支（遺傳分支1—4），不過(guò)這種遺傳基因的區(qū)別似乎沒(méi)有明顯的臨床癥狀的差異。另外一種短螺旋菌屬Brachyspira suanatina受地域限制較大，迄今為止僅在歐洲的丹麥和瑞典出現(xiàn)過(guò)。3種短螺旋菌屬的共同特性是在血液瓊脂培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生嚴(yán)重的β-溶血，該癥狀已被建議作為豬痢疾臨床分離菌株的毒力指標(biāo)。目前對(duì)豬痢疾短螺旋體的全基因組進(jìn)行測(cè)序，揭示了7種潛在的溶血素基因，其中4種已經(jīng)有所報(bào)道

螺旋體屬還包括許多弱溶血性螺旋體菌，它們通常定制于豬結(jié)腸內(nèi)，包括B.innocens、B.Intermedia、B.murdochii和 B.pilosicoli。其中 B.pilosicoli是豬腸道螺旋體病的病原體，其他的菌株致病性較低，目前并未見有關(guān)弱溶血性螺旋體菌與嚴(yán)重血性腹瀉相關(guān)性研究的報(bào)道。

2 發(fā)病機(jī)理

豬痢疾短螺旋體至少需要一種其他的微生物參與才能導(dǎo)致豬痢疾的病變，僅使用豬痢疾短螺旋體感染無(wú)菌豬并不致病，而口服注射帶病的豬腸道碎片和內(nèi)容物可以導(dǎo)致豬痢疾典型癥狀。芳華雙歧桿菌（Bacteroides vulgatus）和壞死梭形桿菌（Fusobacterium necrophorum）這兩種厭氧菌被證實(shí)是能夠滿足要求的參與微生物。豬痢疾短螺旋體的自然傳播主要是由于誤食受感染的糞便導(dǎo)致。螺旋體經(jīng)過(guò)食道到達(dá)胃部，并能夠經(jīng)受胃酸的作用，通過(guò)小腸到達(dá)最終的目的地盲腸和結(jié)腸進(jìn)行寄生和繁殖。目前自然感染豬痢疾的實(shí)際感染劑量并不清楚，但根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃徒臃N實(shí)驗(yàn)，初步估計(jì)至少需要105CFU的致病劑量。

豬痢疾短螺旋體一旦進(jìn)入易感豬體內(nèi)，立即定植于腸黏膜層，甚至在更深層的腸隱窩也能發(fā)現(xiàn)它們的身影，目前已經(jīng)證明這種現(xiàn)象的產(chǎn)生機(jī)理一方面跟豬黏液蛋白的趨化作用相關(guān)，另一方面跟鞭毛運(yùn)動(dòng)相關(guān)。豬痢疾短螺旋體通過(guò)鞭毛螺旋樣運(yùn)動(dòng)—生物滲透進(jìn)入腸黏膜層，鞭毛的活性受FlaA和FlaB基因的調(diào)控。目前已有報(bào)道證明FlaA和FlaB基因的突變能夠降低豬痢疾短螺旋體的定植能力。短螺旋體定植于腸黏膜對(duì)于豬痢疾病癥的發(fā)展有重要作用，由于豬痢疾短螺旋體會(huì)代謝大量的氧氣，同時(shí)NADH氧化酶活性對(duì)短螺旋體的定植能力也十分重要，定植于腸黏膜層和隱窩能有效降低氧毒性對(duì)短螺旋體的傷害，保護(hù)短螺旋體的正常繁殖和增長(zhǎng)。

豬痢疾短螺旋體定植于腸黏膜后，一般在臨床癥狀出現(xiàn)前1～4天，豬糞便中就會(huì)出現(xiàn)螺旋體。感染實(shí)驗(yàn)證明，注射感染后7～10天能夠出現(xiàn)明顯豬痢疾癥狀，一般3周內(nèi)發(fā)病率接近或超過(guò)90%。使用B.hampsonii做感染實(shí)驗(yàn)，癥狀出現(xiàn)較早，一般在感染后的4～5天，發(fā)病率卻低于90%。實(shí)驗(yàn)證明感染劑量對(duì)于病癥的發(fā)展至關(guān)重要，105CFU的感染劑量能夠產(chǎn)生豬痢疾的臨床癥狀，而低于105CFU幾乎無(wú)剖檢癥狀。

豬痢疾短螺旋體感染早期會(huì)引起隱窩基底杯狀細(xì)胞內(nèi)的黏蛋白原減少，同時(shí)刺激腸腔擴(kuò)張從而排出隱窩中積聚的黏液。盲腸插管內(nèi)窺鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黏液排出一般發(fā)生在病程的第3天，而杯狀細(xì)胞增生發(fā)生于第5天。組織化學(xué)分析結(jié)果顯示在患有急性豬痢疾病豬的結(jié)腸頂部隱窩內(nèi)，有硫酸黏蛋白表達(dá)量降低和唾液酸黏蛋白表達(dá)量增加的現(xiàn)象。免疫組化實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步揭示了無(wú)論是豬痢疾短螺旋體還是B.hampsonii感染，豬痢疾癥狀出現(xiàn)48小時(shí)之后都會(huì)導(dǎo)致黏蛋白2（MUC2）特異性減少和黏蛋白5AC（MUC5AC）的增加。黏蛋白 2（MUC2）是健康豬杯狀細(xì)胞中占主導(dǎo)地位的黏蛋白，它主要表達(dá)于結(jié)腸頂部，在豬痢疾癥狀出現(xiàn)72小時(shí)之后會(huì)大量排出進(jìn)入隱窩。而黏蛋白5AC在健康豬的結(jié)腸內(nèi)幾乎檢測(cè)不到，只有在急性豬痢疾發(fā)病時(shí)才出現(xiàn)。

早期豬痢疾的微病變包括淺表黏膜壞死、固有層中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、隱窩牽伸、出血和大量黏液分泌。病變部位分布大量豬痢疾短螺旋體細(xì)胞，主要集中于結(jié)腸管腔表面以及上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、黏液滴和固有層內(nèi)。患病豬結(jié)腸上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)一致，包括微絨毛稀少、線粒體腫脹、細(xì)胞器數(shù)量減少。隨著病變的進(jìn)一步發(fā)展，表面黏膜開始出現(xiàn)侵蝕出血、纖維蛋白滲出等癥狀。肉眼病變主要局限于盲腸和結(jié)腸，通常包括弛緩性漿膜充血以及腸系膜水腫膨脹。結(jié)腸病變常有大量黏液、出血、黏膜表面纖維素性滲出物，伴隨黏膜出血性水樣糞便。隨著病程進(jìn)一步加重，腸道吸收不良，鈉氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，腹瀉成為下一階段最重要的癥狀。

豬痢疾發(fā)病過(guò)程中，循環(huán)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞有顯著增加，急性期蛋白血清淀粉樣蛋白A（SAA）和結(jié)合珠蛋白含量也有提高，不過(guò)發(fā)熱反應(yīng)并不明顯。臨床癥狀出現(xiàn)的第1天，促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）1β增加明顯；黏膜出血性腹瀉持續(xù)到第3天，SAA水平可以升高到基線水平的6倍以上。痢疾期間血清中一些不必要的糖異生氨基酸如丙氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸濃度下降。隨著疾病的進(jìn)展，患病豬開始出現(xiàn)脫水、代謝性酸中毒和高鉀血癥，嚴(yán)重的甚至可以引起死亡。疾病進(jìn)展到第5天開始進(jìn)入恢復(fù)期，血液中SAA、結(jié)合珠蛋白以及單核細(xì)胞水平開始逐漸降低；而白細(xì)胞介素10（IL10）水平開始增高并在恢復(fù)期第7天達(dá)到峰值。

感染能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫反應(yīng)，主要包括產(chǎn)生針對(duì)膜相關(guān)脂蛋白A和B（SmpA和SmpB）抗體，這些抗體早在恢復(fù)期的第1天就能檢測(cè)出來(lái)。試驗(yàn)證明恢復(fù)期與免疫球蛋白G、A和M有極大的關(guān)系，豬痊愈后能夠避免再次感染豬痢疾，保護(hù)期可達(dá)17周。

3 診斷方法

豬痢疾的診斷一般基于臨床癥狀、特征性病變（眼觀和顯微鏡下）、結(jié)腸組織或糞便強(qiáng)β溶血螺旋體的分離等因素進(jìn)行綜合判斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的興起，活體診斷技術(shù)開始發(fā)展，出現(xiàn)了大量關(guān)于豬痢疾短螺旋體分子診斷方法的報(bào)道，其中以糞便和液體樣本的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和原位雜交（ISH）技術(shù)最為重要。

3.1 微生物培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)豬痢疾短螺旋體的靈敏度較高，不過(guò)這很大程度上取決于樣本的前處理和樣本本身。藥物能大大降低短螺旋體的分離率，因此應(yīng)該選擇未處理的、新鮮的臨床樣本。樣本運(yùn)輸需要冷藏并保持潮濕。短螺旋體需要在典型的選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行分離，厭氧培養(yǎng)6～10天，能夠誘導(dǎo)鮮血瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)β-溶血環(huán)。初代培養(yǎng)的短螺旋體通常需要利用各種生化試驗(yàn)、特異性PCR、基因的部分測(cè)序，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析以及基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜等方法做進(jìn)一步鑒定。

3.2 PCR

對(duì)于大多數(shù)傳染病病原體，對(duì)臨床樣本進(jìn)行直接PCR檢測(cè)是最常用也是最高效的手段，但需要指出的是對(duì)于豬痢疾短螺旋體屬來(lái)說(shuō)，直接檢測(cè)臨床樣本的靈敏度并不高，需要進(jìn)行病原體初代培養(yǎng)。培養(yǎng)后的樣本使用PCR方法能夠輕易區(qū)分，目標(biāo)基因包括基因、16S rRNA基因、23S rDNA基因以及溶血素基因。這極大地提高檢測(cè)的特異性，但對(duì)于新出現(xiàn)的菌種，PCR的方法可能也無(wú)能為力。

3.3 原位雜交

原位雜交是一種新興的、高度特異的檢測(cè)方法，可以直接檢測(cè)組織內(nèi)感染物。這種方法結(jié)合了PCR的高特異性和顯微鏡的直接可視性，是一種很有前途的檢測(cè)技術(shù)。目前該方法已應(yīng)用于豬痢疾短螺旋體、B.pilosicoli、B.murdochii和 B hampsonii的診斷檢測(cè)。

3.4 血清學(xué)檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）作為豬痢疾螺旋體屬的診斷方法已被證實(shí)是有效的，該技術(shù)通過(guò)檢測(cè)抗脂多糖抗體從而實(shí)現(xiàn)豬痢疾短螺旋體的鑒別診斷，但該方法僅適用于某些血清型，并不能廣泛應(yīng)用。目前已經(jīng)開發(fā)出一種檢測(cè)循環(huán)抗體的ELISA方法，它的主要作用靶點(diǎn)是外膜脂多糖特異性抗體，研究結(jié)果顯示該方法具有更高的靈敏度和特異性，但目前還未見大規(guī)模推廣。

4 豬痢疾傳播和感染的影響因素

豬痢疾在農(nóng)場(chǎng)的傳播主要影響因素包括傳播途徑、飲食結(jié)構(gòu)等。嚙齒動(dòng)物被認(rèn)為是主要的螺旋體屬載體，并且是豬場(chǎng)內(nèi)最重要的傳染源。有學(xué)者證實(shí)小鼠感染豬痢疾短螺旋體并不致病，但可以散播菌種長(zhǎng)達(dá)200天。豬場(chǎng)污水和糞便是另一個(gè)重要的豬痢疾短螺旋體傳染源，尤其是用于清洗豬舍柵欄的廢水。有研究證明豬痢疾短螺旋體在污水中可以存活17天，在淤泥中可以存活21天，在低于10℃的糞便中能夠存活48小時(shí)。

野生鳥類是豬痢疾短螺旋體在豬場(chǎng)間傳播的又一重要載體，目前已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)證實(shí)了上述結(jié)論。瑞典綠頭鴨的糞便中發(fā)現(xiàn)螺旋體屬B.suanatina和B.hyodysenteriae，同時(shí)加拿大雪鵝、西班牙綠頭鴨和灰雁的糞便中也發(fā)現(xiàn)了螺旋體屬B.hampsonii。動(dòng)物回歸試驗(yàn)證實(shí)上述螺旋體屬均能導(dǎo)致豬痢疾臨床癥狀的發(fā)生。目前越來(lái)越多的學(xué)者開始關(guān)注禽源螺旋體屬，并針對(duì)飛禽影響豬痢疾的傳播等項(xiàng)目展開研究。

豬痢疾疾病的發(fā)展還受到日糧結(jié)構(gòu)和結(jié)腸微生物菌群的影響。不同的日糧飼料對(duì)豬痢疾臨床表現(xiàn)有不同程度的影響，雖然文獻(xiàn)中有一些爭(zhēng)論的聲音，但一般都認(rèn)為添加易消化的日糧有助于減輕豬痢疾短螺旋菌的臨床危害，而經(jīng)常飼喂碳水化合物和木質(zhì)素日糧則容易加重豬痢疾的臨床癥狀。短螺旋體導(dǎo)致豬痢疾臨床癥狀的出現(xiàn)需要其他協(xié)同細(xì)菌的參與，而不同的日糧改變了結(jié)腸微生物菌群結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致協(xié)同細(xì)菌數(shù)量的變化。被改變數(shù)量的協(xié)同細(xì)菌可能增強(qiáng)或減少螺旋體菌的定植，從而影響豬痢疾病程的發(fā)展。最近的研究顯示豬胃腸道中至少4種不同的細(xì)菌可以抑制體外生長(zhǎng)豬痢疾短螺旋體，專家建議結(jié)腸微生物環(huán)境中添加這些細(xì)菌對(duì)于預(yù)防豬痢疾是有利的?？偟膩?lái)說(shuō)，膳食結(jié)構(gòu)是影響豬痢疾發(fā)展的一個(gè)主要因素，并可能影響疾病的發(fā)病時(shí)間和嚴(yán)重程度。應(yīng)該進(jìn)一步研究具體日糧成分對(duì)結(jié)腸微生物菌群的影響，探討豬痢疾預(yù)防中具體的管理手段。

5 治療和控制

治療豬痢疾最常用藥物是截短側(cè)耳類抗生素，主要是泰妙菌素和沃尼妙林。豬痢疾發(fā)病24小時(shí)之內(nèi)使用0.006%泰妙菌素水溶液治療，可以有效遏制腹瀉，阻止豬痢疾短螺旋體的定植。不幸的是截短側(cè)耳類抗生素耐藥現(xiàn)象也層出不窮，目前包括捷克、斯洛伐克、德國(guó)、意大利、西班牙等多個(gè)歐美國(guó)家相繼發(fā)現(xiàn)豬痢疾短螺旋體耐藥菌株。最近一項(xiàng)研究證實(shí)了一株意大利豬痢疾短螺旋體耐藥菌株已經(jīng)蔓延到整個(gè)歐洲。因此，在治療豬痢疾過(guò)程中要密切監(jiān)測(cè)螺旋體菌MIC，合理使用抗生素，不能濫用抗菌藥物。

由于豬痢疾短螺旋體的不同血清型之間缺乏有效的免疫交叉保護(hù)作用，豬痢疾免疫疫苗的研發(fā)十分具有挑戰(zhàn)性。雖然多次嘗試應(yīng)用菌株和弱毒菌株開發(fā)新型高效免疫疫苗，但目前能用的商業(yè)化疫苗還未普及。越來(lái)越多的研究團(tuán)體將希望寄托于基因工程疫苗技術(shù)，努力開發(fā)不同保護(hù)水平的重組疫苗。目前豬痢疾在北美洲開始肆虐，并且在歐洲發(fā)現(xiàn)了耐藥菌株，高效疫苗的開發(fā)已迫在眉睫。

6 展望

豬痢疾病已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)近一個(gè)世紀(jì)，但該病的確切發(fā)病機(jī)制仍然未闡述清楚，有待進(jìn)一步的研究。歷史上一直將豬痢疾短螺旋體認(rèn)為是豬痢疾的唯一病原，主要是由于豬痢疾短螺旋體是唯一的強(qiáng)β-溶血病原體。近些年來(lái)，研究者又發(fā)現(xiàn)了2種新的強(qiáng)β-溶血菌株Brachyspira suanatina和Brachyspira hampsonii，它們也可以導(dǎo)致豬黏膜出血性腸炎以及其他痢疾臨床典型癥狀。因此有學(xué)者就建議要將豬痢疾病原范圍擴(kuò)大，但凡能引起豬痢疾典型癥狀的所有強(qiáng)β-溶血螺旋體菌株均是主要病原體。

理想的診斷產(chǎn)品應(yīng)該是一方面能夠盡可能多地檢測(cè)出所有潛在的病原螺旋體菌，另一方面還應(yīng)具有足夠的靈敏度，能夠檢測(cè)出低水平的帶菌動(dòng)物。近些年新檢測(cè)技術(shù)快速崛起，大大提高了短螺旋體屬的診斷特異性，其中分子診斷技術(shù)發(fā)展最快。尋找豬痢疾病原的通用特異性基因是目前分子診斷研究的熱點(diǎn)。

（參考文獻(xiàn)略，需者可函索）

譯自：Burrough ER.Swine dysentery:etiopathogenesis and diagnosis of a reemerging disease [J].Veterinary Pathology,2017,54(1):22-31.