骨靶向治療研究進(jìn)展

譚喬燕 謝楊麗 李燦 羅鳳濤 陳林

陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院康復(fù)理療科/骨代謝與修復(fù)中心/全軍戰(zhàn)創(chuàng)傷中心創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)室/創(chuàng)傷、燒傷、復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042

骨骼不僅是生物體重要的力學(xué)支持器官，也是機(jī)體的鈣磷庫(kù)，對(duì)維持體內(nèi)鈣磷的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。骨形成過程中，間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和密集，然后逐步分化為成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞分泌類骨質(zhì)，并被包埋其中，成為骨細(xì)胞，繼而類骨質(zhì)鈣化成骨基質(zhì)，最后形成骨組織。成骨過程中，成骨細(xì)胞還可以通過分泌核轉(zhuǎn)錄因子受體、骨保護(hù)素和巨噬細(xì)胞集落刺激因子等來(lái)調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和激活。骨重建是維持成年期骨代謝和力學(xué)功能的重要機(jī)制，需要成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨形成作用和破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨吸收間的動(dòng)態(tài)平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)。任何一方數(shù)量或功能的變化必然破壞骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡，影響骨代謝，嚴(yán)重時(shí)可引起骨質(zhì)疏松、佩吉特病、轉(zhuǎn)移性骨腫瘤等疾病[1]。

1986年P(guān)ierce等[2]首次提出“骨靶向”概念。為骨骼相關(guān)疾病的治療提供了新策略。靶向遞送不僅提高藥物利用率，還能減輕藥物毒副作用。本文根據(jù)靶向目標(biāo)不同將骨骼靶向藥物遞送系統(tǒng)分為兩種，一種是靶向整個(gè)骨組織；另一種是靶向骨組織里的細(xì)胞。

1 靶向骨組織

骨組織干重的35%是天然有機(jī)成分膠原，其余主要由無(wú)機(jī)羥基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2,HA]構(gòu)成[3]，所含鈣占人體總鈣量的99%。部分化合物分子可摻入HA同骨組織中鈣結(jié)合，從而沉積于骨。因此，凡與HA有特異親和力的物質(zhì)，都可作為骨組織靶向藥物或靶向載體，從而使藥物能特異性地作用于骨組織。

1.1 四環(huán)素類(tetracyclines,TCs)

TCs通過替換HA中的2個(gè)PO43-，與Ca2 +絡(luò)合形成金屬配合物，從而沉積于骨組織并摻入到新生骨或牙齒中。Wang 等[4]將聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolic acid,PLGA)]的末端羧基與骨靶向基團(tuán)TC的羥基進(jìn)行酯化反應(yīng)得到TC-PLGA復(fù)合物，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記TC-PLGA發(fā)現(xiàn)納米粒能較好的被靶向組織攝取，在骨組織中的分布比普通納米粒提高80.6%。此外，TCs也可連接藥物作為骨靶向藥物的載體。如將四環(huán)素中三羰基甲烷環(huán)A與雌二醇結(jié)合，三羰基甲烷環(huán)A選擇性結(jié)合雌激素受體α，從而將雌二醇傳遞并聚集在骨組織，減少其在非骨組織的蓄積與作用，提高雌二醇治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的安全性[5]。

1.2 雙膦酸鹽類 (bisphosphonates,BPs)

BPs是天然焦磷酸的類似物，分子結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)末端磷酸鍵(P-C-P)是靶向骨組織的必要條件。 磷酸基對(duì)鈣化組織有較強(qiáng)親和力，可與骨表面HA有效結(jié)合，抑制HA的繼續(xù)形成、聚集及溶解，從而抑制骨吸收[6]，因此，BPs可作為藥物單獨(dú)用于治療骨質(zhì)疏松癥、佩吉特病及轉(zhuǎn)移性骨腫瘤等骨吸收增多性疾病[1]。但使用前對(duì)腎功能的要求及其可能導(dǎo)致的腎毒性、頜骨壞死、骨關(guān)節(jié)疼痛等癥狀在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。因此，迫切需要對(duì)BPs進(jìn)行修飾提高其利用率。納米粒是研究比較成熟的藥物載體，由于其親水表面和小粒徑特性，一方面使其避免巨噬系統(tǒng)的吞噬識(shí)別；另外還可延長(zhǎng)其在血液中的循環(huán)時(shí)間。Katsumi等[7]研究發(fā)現(xiàn)阿侖膦酸經(jīng)聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)納米粒包裹后顯著提高在血液中的循環(huán)時(shí)間和靶向骨的能力。Rawat 等[8]將BPs經(jīng)PEG-PLGA納米粒包裹后作用于骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)BPs毒性降低，骨質(zhì)疏松治療療效提高。此外，BPs還可作為靶向載體與各種藥物分子連接形成骨組織的靶向藥物。如Sedghizadeh 等[9]將BPs結(jié)合環(huán)丙沙星形成偶聯(lián)物BV600022，體外研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)pH值，BV600022緩慢釋放環(huán)丙沙星，起到持續(xù)抑菌效果，進(jìn)一步利用假體骨髓炎大鼠模型發(fā)現(xiàn)單次小劑量(10 mg/kg)腹腔注射BV600022可達(dá)到與三次大劑量(30 mg/kg)注射環(huán)丙沙星相同的抑菌效果。

1.3 仿生蛋白類

1.3.1膠原結(jié)合區(qū) (collagen binding domain,CBD):骨骼有機(jī)成分中I型膠原占了絕大部分，多種蛋白如甲狀旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor 1α,SDF-1α)可通過與CBD結(jié)合，進(jìn)而靶向骨骼。Ponnapakkam等[10]將PTH與CBD融合后單次腹腔內(nèi)注射可顯著提高小鼠的骨密度。在大鼠股骨缺損模型中，CBD-SDF-1α與脫鈣骨基質(zhì)支架結(jié)合植入缺損部位3 d，發(fā)現(xiàn)CBD-SDF-1α可募集C-kit和CD34陽(yáng)性的內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢，顯著促進(jìn)骨重塑[11]。

1.3.2小肽類:骨形成表面覆蓋成骨細(xì)胞以低晶體化的磷灰石為主，而骨吸收表面覆蓋破骨細(xì)胞以高晶體化的磷灰石為主[12]。牙本質(zhì)磷蛋白是牙本質(zhì)胞外基質(zhì)中的一種主要非膠原蛋白，在牙齒發(fā)育過程啟動(dòng)牙本質(zhì)礦化和調(diào)節(jié)HA晶體生長(zhǎng)速度中起重要作用，根據(jù)牙本質(zhì)磷蛋白序列合成系列對(duì)鈣磷有較高親和力的小于25個(gè)氨基酸的肽，以多次重復(fù)三肽Asp-Ser-Ser(DSS)n為特征，與HA 的親和力隨(DSS)n重復(fù)次數(shù)成正相關(guān)[13]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)(DSS)6[14]特異與低晶體化的磷灰石結(jié)合從而靶向于骨形成表面。根據(jù)與HA可能結(jié)合位點(diǎn)處重復(fù)氨基酸序列(Asp or Glu)，合成與HA特異結(jié)合的非膠原蛋白(Asp)6[15]和(Asp)8[16]，用FITC作標(biāo)記(Asp)6，大鼠靜脈注射(Asp)6-FITC后24 h取材，發(fā)現(xiàn)骨骼和牙齒均有熒光標(biāo)記，而軟組織中無(wú)熒光標(biāo)記，且血液中(Asp)6-FITC的半衰期由FITC的1 h延長(zhǎng)到14 d。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)(Asp)6和(Asp)8小肽特異與高晶體化的磷灰石結(jié)合從而靶向于骨吸收表面。

1.4 放射性藥物類

對(duì)于廣泛性腫瘤骨轉(zhuǎn)移出現(xiàn)的嚴(yán)重骨疼痛，放射性核素導(dǎo)向治療是近年來(lái)發(fā)展較快、療效較好的一種手段。如Strontium、Lanthanides 等親骨性放射性核素，由于與鈣類似的物理及化學(xué)特性，吸收后優(yōu)先沉積于骨組織，并參與骨礦物質(zhì)的代謝過程[17]。89SrCl2是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)緩解骨轉(zhuǎn)移的放射性藥物，Strontium模擬鈣聚集在轉(zhuǎn)移部位，誘導(dǎo)礦化過程中骨細(xì)胞周圍胞外基質(zhì)的聚集，提高成骨細(xì)胞活性及骨形成能力[18]。

2 靶向細(xì)胞

由于藥物無(wú)法分辨骨組織里的不同細(xì)胞，在治療過程中，靶向骨組織的藥物遞送將作用于所有細(xì)胞。因此，迫切需要更為精確與安全的靶向細(xì)胞的遞送系統(tǒng)。

2.1 靶向成骨細(xì)胞

核酸適配子是一類廣泛應(yīng)用于藥物靶向遞送的單鏈寡核苷酸。2015年，Liang等[19]利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)，以大鼠原代成骨細(xì)胞和人原代成骨細(xì)胞為靶標(biāo)，大鼠肝細(xì)胞系BRL-3 A和PBMCs為消減靶子，成功篩選到靶向成骨細(xì)胞的核酸適配子CH6，結(jié)合脂質(zhì)體納米粒包被Plekho1基因(成骨基因pleckstrin同源性家族O成員1)的siRNA，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CH6-LNPs-siRNA促使成骨細(xì)胞通過巨胞飲選擇性攝取Plekho1 siRNA。在健康與卵巢切除大鼠骨質(zhì)疏松模型中，CH6可加強(qiáng)成骨細(xì)胞特異性的Plekho1基因沉默，促進(jìn)骨形成及改善骨微結(jié)構(gòu)，最終實(shí)現(xiàn)卵巢切除大鼠的骨量增加及骨骼機(jī)械性能恢復(fù)。

多肽由于空間結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分子量小，特異性高，滲透力強(qiáng)，且不易被酶類識(shí)別和降解，免疫原性低等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于藥物靶向遞送。Sun等[20]利用噬菌體展示技術(shù)，以小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1和人成骨細(xì)胞系hFOB1.19為靶標(biāo)，篩選到特異靶向小鼠和人成骨細(xì)胞的多肽Ser-Asp-Ser-Ser-Asp (SDSSD)，通過親和色譜法和細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SDSSD多肽與成骨細(xì)胞特異因子2有較高親和力，結(jié)合聚氨酯 (Polyurethane,PU) 納米膠束包被anti-miR-214，建立靶向成骨細(xì)胞的核酸遞送系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)SDSSD-PU將anti-miR-214特異性遞送至骨形成面的成骨細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)骨形成，改善骨骼力學(xué)性能。

2.2 靶向破骨細(xì)胞

破骨細(xì)胞表面的粘附分子整合素αVβ3，通過精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列在破骨細(xì)胞黏附至骨基質(zhì)及骨吸收活性發(fā)揮中起重要作用。整合素αVβ3能激活巨噬細(xì)胞依賴的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)破骨細(xì)胞的發(fā)育、遷移，骨吸收及炎癥形成。MEDI-522(又名Vitaxin)是一種與αVβ3亞基特異結(jié)合的人源性單克隆抗體，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)Vitaxin能阻止整合素αVβ3與其各種配體如骨橋蛋白和玻連蛋白的結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)而阻止后續(xù)炎癥形成及骨吸收作用[21]。

miRNA在調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)中起重要作用。老年女性骨折及卵巢切除小鼠的骨形成減少與破骨細(xì)胞miR-214-3p增高導(dǎo)致的血清外泌體miR-214-3p增高直接相關(guān)，miR-214-3p通過結(jié)合成骨轉(zhuǎn)化因子抑制成骨細(xì)胞的活性和基質(zhì)礦化。使用D-Asp8將miR-214-3p 拮抗劑靶向破骨細(xì)胞可抑制其miR-214-3p的表達(dá)，繼而促進(jìn)卵巢切除衰老小鼠骨形成[22]。

2.3 靶向骨細(xì)胞

早期腫瘤骨轉(zhuǎn)移過程中，乳腺癌細(xì)胞通過分泌甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白刺激骨細(xì)胞釋放核轉(zhuǎn)錄因子受體、骨保護(hù)素和硬骨素，進(jìn)而調(diào)控破骨細(xì)胞生成和加速腫瘤骨轉(zhuǎn)移。Qiao等[23]研究發(fā)現(xiàn)唑來(lái)膦酸對(duì)早期腫瘤骨轉(zhuǎn)移部位骨細(xì)胞有較高親和力，唑來(lái)膦酸和白花丹素可協(xié)同作用緩解腫瘤轉(zhuǎn)移引起的骨破壞。唑來(lái)膦酸和白花丹素結(jié)構(gòu)模擬三磷酸腺甘酸競(jìng)爭(zhēng)抑制成骨細(xì)胞環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和氨基末端激酶的磷酸化，從而抑制轉(zhuǎn)移微環(huán)境內(nèi)骨細(xì)胞分泌核轉(zhuǎn)錄因子受體和硬骨素[24]。進(jìn)一步研究建立了pH響應(yīng)的靶向骨細(xì)胞藥物遞送系統(tǒng)，以唑來(lái)膦酸為靶頭并載藥白花丹素的納米顆粒PUCZP，研究發(fā)現(xiàn)PUCZP靶向骨細(xì)胞，pH響應(yīng)釋放白花丹素，抑制成骨細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成及骨溶解，從而抑制腫瘤骨轉(zhuǎn)移[25]。

2.4 靶向干細(xì)胞

Iwagawa等[26]通過消減SELEX技術(shù)，以小鼠胚胎干細(xì)胞系為靶標(biāo)，小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞系A(chǔ)9為消減靶子，L1-65為競(jìng)爭(zhēng)適配體，篩選到靶向小鼠胚胎干細(xì)胞的核酸適配子，通過MPBind從已有適配子序列中分析預(yù)測(cè)得到8種和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞特異結(jié)合的核酸序列[27]，選擇親和力最高的序列Apt19進(jìn)行系列平截，得到特異靶向誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的核酸適配子Apt19S[28]。在骨軟骨缺損模型中，Apt19S結(jié)合雙層支架可募集內(nèi)源性間充質(zhì)干細(xì)胞從骨髓到缺損部位， 分別促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，顯著提高缺損修復(fù)能力[29]。

間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)多種整合素亞基，如α1、2、3、4、6、11、CD51(αV)和CD29(β1)，成骨細(xì)胞表達(dá)整合素β1亞基，間充質(zhì)干細(xì)胞過表達(dá)整合素α4亞基可促進(jìn)干細(xì)胞的募集及向成骨細(xì)胞分化[30]。Yao等[31]發(fā)現(xiàn)，小分子多肽模擬物L(fēng)LP2A可有效結(jié)合間充質(zhì)干細(xì)胞表面整合素受體α4β1，LLP2A與阿倫膦酸鈉 (Alendros,Ale)結(jié)合制成肽模擬復(fù)合物L(fēng)LP2A-Ale，可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和成骨分化能力。在異種移植和具免疫活性小鼠中，單次靜脈注射LLP2A-Ale可顯著促進(jìn)股骨和脊柱骨小梁的形成。此外，LLP2A-Ale還可防止雌激素缺乏引起的小梁骨丟失，進(jìn)而提高骨密度和骨量。

3 討論與展望

綜上所述，新型靶向細(xì)胞特異性遞送系統(tǒng)，理論上可以將具有治療效應(yīng)的藥物通過精準(zhǔn)識(shí)別來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性遞送，從而推動(dòng)靶向藥物的研發(fā)。骨性關(guān)節(jié)炎為關(guān)節(jié)慢性進(jìn)行性病變，是以關(guān)節(jié)軟骨退化、變性和繼發(fā)的軟骨增生、骨化為主要病理變化的一種疾病，由于關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)無(wú)血管、神經(jīng)及淋巴管，關(guān)節(jié)軟骨的自我修復(fù)能力極差。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的研究較多，但仍缺乏能有效安全防治骨性關(guān)節(jié)炎的藥物。

IL-17/IL-17RA介導(dǎo)炎癥因子IL-1、6、8的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控蛋白水解酶活性，促進(jìn)基質(zhì)降解，參與關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。Chen等[32]通過SELEX技術(shù)，以NIH3T3細(xì)胞系為對(duì)照，IL-17RA-缺陷的NIH3T3細(xì)胞系為靶標(biāo)，篩選到特異結(jié)合IL-17RA的核酸適配子RA10-6，在大鼠內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)定手術(shù)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中，關(guān)節(jié)腔注射適配子RA10-6可有效緩解關(guān)節(jié)炎引起的滑膜增厚表型，這是建立在已知靶分子基礎(chǔ)上的靶向細(xì)胞治療。目前仍未見直接靶向軟骨細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道，因此，篩選早期靶向關(guān)節(jié)炎樣細(xì)胞的適配子，有助于防治骨性關(guān)節(jié)炎藥物的研發(fā)。