豬繁殖與呼吸綜合征最新研究進(jìn)展及防控方法

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(1.建德市正創(chuàng)生態(tài)養(yǎng)殖場，浙江建德 311600； 2.浙江大飛龍動物保健品股份有限公司)

豬繁殖與呼吸綜合征，又稱藍(lán)耳病，1987年在美國北卡羅萊納州爆發(fā)，最初因不能確定其病因，故一度稱為“神秘病”。1991年荷蘭學(xué)者分離到該病的病原LV株，歐盟將此病命名為“豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)”，顧名思義，PRRS病毒既能影響種豬的繁殖性能，又以呼吸道疾病的方式影響豬的生長性能。

我國于1996年由郭寶清等人首次從發(fā)病豬群中分離出藍(lán)耳病毒。2006年6月至10月，先后在江西、安徽、浙江、湖南、湖北、江蘇等省部分地區(qū)有212萬頭豬發(fā)生“高熱病”，超過40萬頭豬死亡，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。2007年4月，農(nóng)業(yè)部正式將其確定為“高致病性豬藍(lán)耳病”。

目前，豬藍(lán)耳病已成為全球范圍內(nèi)流行最廣，危害最嚴(yán)重的重大傳染病之一，60%-80%豬群受到感染危脅，臨床表現(xiàn)己從“流產(chǎn)風(fēng)暴”為特征的暴發(fā)型轉(zhuǎn)向損害保育豬為特征的“呼吸障礙”型，并已成為仔豬、育肥豬呼吸綜合征(PRDC)最主要的原發(fā)性病原，根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)資料，藍(lán)耳病對育肥豬造成的平均損失估計(jì)在15.25-18.21美元/頭之間，折算成人民幣約為93.33-111.45元/頭[1]。

1 豬藍(lán)耳病危害現(xiàn)狀

1.1豬場感染率高 當(dāng)前我國豬場藍(lán)耳病感染率，抗體陽性率較高，當(dāng)然抗體陽性率居高不下，這與豬場長期免疫藍(lán)耳病疫苗有關(guān)。很多原種豬場嘗試進(jìn)行藍(lán)耳病的凈化工作，通過封群，淘汰取得了不錯的進(jìn)展，但是由于豬場內(nèi)外圍生物安全等問題，很難長時間保持陰性，且一旦感染轉(zhuǎn)陽，風(fēng)險(xiǎn)更大。

1.2病毒毒株多，變異速度快 目前，大量臨床檢測數(shù)據(jù)表明，很多豬場存在多種藍(lán)耳病毒株，造成毒株多樣性的主要原因，首先是藍(lán)耳病病毒屬于RNA病毒，容易變異；其次，就是豬場長時間、高頻率的免疫藍(lán)耳病弱毒疫苗，在這種高壓抗體選擇下，更加加快了藍(lán)耳病毒的變異速度，再加上很多豬場頻繁的更換不同毒株的藍(lán)耳病弱毒疫苗，人為地增加了豬場藍(lán)耳病病毒的多樣性；其三就是藍(lán)耳病弱毒疫苗的毒株與野毒發(fā)生重組，形成新的毒株。

1.3臨床表現(xiàn)復(fù)雜 目前豬場爆發(fā)藍(lán)耳病之后的臨床表現(xiàn)比較復(fù)雜。母豬群在感染之后，相比較前出現(xiàn)大規(guī)模流產(chǎn)的現(xiàn)象在減少，主要表現(xiàn)為早產(chǎn)、死胎、弱仔比率增加，同時可繁母豬出現(xiàn)明顯的不發(fā)情、乏情、返情等繁殖障礙。但在2015年以后，由于類NADC-30毒株的出現(xiàn)，在一部分豬場感染藍(lán)耳病后，出現(xiàn)了流產(chǎn)高峰，說明該毒株毒力比較強(qiáng)，且主要引起母豬流產(chǎn)，這一定要引起養(yǎng)豬場(戶)的高度關(guān)注。由于產(chǎn)房和保育舍容易造成細(xì)菌和病毒(PCV-2、PRV、PIV、APP、HP等)的繼發(fā)感染，因此引起的臨床表現(xiàn)更加復(fù)雜。

1.4豬場持續(xù)循環(huán)感染 藍(lán)耳病持續(xù)感染是PRRS流行病學(xué)的重要特征之一。豬群在攻毒后的210 d后仍可檢測到RNA，育肥豬在感染后其病毒血癥持續(xù)至少4周左右，甚至更長時間，而成為PRRSV的儲存宿主，并持續(xù)向環(huán)境中排毒，造成其它豬群的循環(huán)感染。這也跟豬場的臨床表現(xiàn)相一致，臨床上，經(jīng)常會看到一些豬場母豬群呈陰性，產(chǎn)房和保育舍陰性可維持到8-9周齡，但9周齡以后就陸續(xù)全部轉(zhuǎn)陽，對于一條龍生產(chǎn)的豬場來講，這是致命的危險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)。因此，控制循環(huán)感染最好的方法，就是做好內(nèi)外生物安全的同時改變生產(chǎn)模式，由一條龍的生產(chǎn)模式變成兩點(diǎn)式生產(chǎn)模式。

2 藍(lán)耳病感染的免疫學(xué)特點(diǎn)

2.1抗PRRSV感染的體液免疫反應(yīng) 藍(lán)耳病感染后7-9 d通過ELISA方法(IDEXX)能夠檢測到PRRSV抗體，但這種抗體主要是針對藍(lán)耳病病毒結(jié)構(gòu)上的N蛋白或某些優(yōu)勢抗原表位產(chǎn)生的，無中和活性，因此不能提供免疫保護(hù)。具有PRRSV中和活性的抗體要在感染后4周或4周后出現(xiàn)。中和抗體產(chǎn)生比較晚，而且低水平維持210 d[2]。研究表明，PRRSV的中和表位位于不同毒株的GP5蛋白上，因此近年來針對GP5蛋白的研究成了熱點(diǎn)。最終發(fā)現(xiàn)PRRSV在感染后誘發(fā)遲發(fā)性的中和抗體的主要原因是GP5蛋白上存在著一個誘導(dǎo)表位，可干擾中和抗體的產(chǎn)生。

PRRSV感染后顯著遲發(fā)性的中和抗體現(xiàn)象，也使臨床上通過免疫藍(lán)耳病弱毒疫苗來防控藍(lán)耳病的過程，出現(xiàn)較長的免疫空白期，增加了感染風(fēng)險(xiǎn)。因此，很多學(xué)者也把疫苗研究重點(diǎn)放在了如何免疫后讓其快速產(chǎn)生中和抗體上。

2.2抗PRRSV感染的細(xì)胞免疫 細(xì)胞免疫在抗藍(lán)耳病感染過程中取得了非常重要的作用，大量研究數(shù)據(jù)表明，PRRSV感染豬在4-12周后，T細(xì)胞開始增殖，對于清除PRRSV發(fā)揮有著重要的作用[3]。特別是CD4T和CD8T淋巴細(xì)胞，CD4T淋巴細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子，起到了抗病毒作用，CD8T淋巴細(xì)胞通過介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用起到了清除病毒感染的細(xì)胞目的[4]。

2.3抗體依耐性增強(qiáng)作用 亞中和抗體水平的存在，不但不能阻止PRRSV的復(fù)制、反而使PRRSV的復(fù)制增強(qiáng)了數(shù)10倍，促進(jìn)了PRRSV的感染，這種現(xiàn)象被稱為抗體依耐性增強(qiáng)作用(ADE)，也是PRRSV的一個重要免疫學(xué)特性。臨床上，ADE現(xiàn)象也給PRRS的防控制造了很大麻煩。仔豬母源抗體水平較低時接種PRRSV弱毒疫苗，其病毒血癥持續(xù)時間延長[5]，表現(xiàn)出ADE[6]，由于ADE的作用使疫苗誘導(dǎo)的抗體可能會增強(qiáng)野毒在豬體內(nèi)的復(fù)制，這給疫苗的研制和應(yīng)用帶來了很大的難度。

2.4PRRSV感染與免疫抑制 目前對于PRRSV造成的免疫抑制在臨床中形成了一致的觀點(diǎn)，PRRSV感染之后導(dǎo)致免疫抑制，形成病毒或細(xì)菌的二次感染，從而加劇感染豬的臨床癥狀和發(fā)病。造成這種現(xiàn)象的主要原因就是PRRSV感染后主要侵害PAM和其它單核細(xì)胞，造成構(gòu)成肺部天然免疫反應(yīng)的第一道屏障，即PAM的破壞而引起免疫抑制或免疫損傷。同時這也部分解釋了PRRSV感染后的體液免疫和細(xì)胞免疫出現(xiàn)的遲緩。

3 藍(lán)耳病防控技術(shù)的研究進(jìn)展

3.1存在的問題 目前，PRRS的流行已經(jīng)給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，我國已先后開發(fā)了藍(lán)耳病滅活疫苗和弱毒疫苗廣泛用于臨床防控。不可否認(rèn)，通過這些疫苗的應(yīng)用，使我國在藍(lán)耳病的防控方面取得了一定的進(jìn)展，但同樣面臨很多問題，其中最突出的就是弱毒疫苗安全性問題和滅活疫苗的有效性問題。另外，就是在藍(lán)耳病的防控過程中過分依賴疫苗，而不注重凈化工作等技術(shù)手段。

3.2研究進(jìn)展 隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，使得對藍(lán)耳病的致病機(jī)理和免疫學(xué)特點(diǎn)有了更進(jìn)一步的了解和發(fā)現(xiàn)，越來越多的學(xué)者開始嘗試用一些新的手段和技術(shù)來防控藍(lán)耳病。

3.2.1做好生物安全措施，逐步凈化藍(lán)耳病 所謂的生物安全就是要阻止外來病原入侵和消除或切斷內(nèi)部的病原傳播。對于藍(lán)耳病來說，本身是一個輸入性的疾病，因此對于豬場首先要做好引種防控工作，避免引入新的PRRSV，其次就是人員的生物安全防控，防止人員帶入PRRSV，其三就是有條件的豬場可以采用空氣過濾系統(tǒng)，阻止豬場內(nèi)PRRSV經(jīng)空氣傳播，最后就是嚴(yán)格的衛(wèi)生消毒措施，降低和清除PRRSV在豬群間的傳播風(fēng)險(xiǎn)。目前，我國已經(jīng)對國家級核心育種場做出了2020年前凈化藍(lán)耳病的要求規(guī)定。

3.2.2新型基因工程疫苗的研發(fā) 傳統(tǒng)的疫苗無論是藍(lán)耳病滅活疫苗，還是弱毒苗都不能完全阻止PRRSV的垂直和水平傳播，只能減輕病毒血癥，減少排毒時間以及緩解臨床癥狀[7]，這與PRRSV自身的一些特性有關(guān)，且弱毒疫苗本身存在著安全性等問題。因此，大家都把目光放到了新型基因工程疫苗的研發(fā)上。

3.2.2.1 核酸疫苗 核酸疫苗(DNA疫苗)是利用基因工程技術(shù)將編碼病毒保護(hù)性抗原的外源性基因片段插入到表達(dá)載體上，再將表達(dá)載體直接接種到動物體內(nèi)，外源基因利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)于體內(nèi)表達(dá)抗原，使機(jī)體產(chǎn)生針對外源性基因的免疫應(yīng)答。研究表明，用插入 ORF5基因的質(zhì)粒免疫豬，可使免疫豬能夠抵抗PRRS強(qiáng)毒的攻擊，并可使豬體產(chǎn)生針對ORF5 的中和抗體[8]。DNA疫苗與其它疫苗相比，既沒有安全性問題，又具有免疫持續(xù)時間較長等優(yōu)點(diǎn)。但是，其免疫效果同樣存在著一定的不確定性，依然存在著很多的挑戰(zhàn)。

3.2.2.2 活載體疫苗 活載體疫苗就是利用分子生物學(xué)技術(shù)將編碼異源病毒特異性抗原的DNA 片段及啟動子調(diào)控序列插入到載體基因組中而構(gòu)建的疫苗，插入基因隨著載體的復(fù)制而表達(dá)。常用于疫苗的載體有腺病毒，痘病毒和偽狂犬病毒等。PRRS 活載體疫苗常用的載體主要為腺病毒和偽狂犬病毒載體，現(xiàn)已成為PRRS疫苗研究的熱點(diǎn)，因?yàn)槠渚哂锌梢酝瑫r激發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答的優(yōu)點(diǎn)，避免了PRRS滅活苗不能快速激發(fā)細(xì)胞免疫的缺點(diǎn)和弱毒苗存在安全性問題的缺點(diǎn)。Qiu等學(xué)者(2005)[9]采用表達(dá)PRRSV GP5 的重組偽狂犬病毒(PRV)疫苗免疫豬體后，發(fā)現(xiàn)免疫后可以保護(hù)豬抵抗強(qiáng)毒攻擊，安全性良好，免疫效果優(yōu)于PRRSV滅活苗。

3.2.2.3 亞單位疫苗 亞單位疫苗，就是利用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)將PRRS主要保護(hù)性抗原蛋白表達(dá)出來，然后用純化蛋白進(jìn)行免疫。目前用來研制亞單位疫苗的主要基因有PRRSV ORF5。目前用于亞單位疫苗研究最多的表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是最早，最簡單，最高效并且使用最廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)，但原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白易形成包涵體，失去活性。Dea等(2000)[10]采用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá) GST-GP5 融合蛋白，免疫豬體后并不能產(chǎn)生中和抗體。桿狀病毒系統(tǒng)有較大的基因組，主要用于昆蟲細(xì)胞的高效表達(dá)。酵母是真核微生物，具有容量大，產(chǎn)量高等特點(diǎn)，便于大規(guī)模生產(chǎn)。Urniza等(1997)[11]用桿狀表達(dá)系統(tǒng)表達(dá) PRRSV GP3和GP5 蛋白，免疫攻毒試驗(yàn)表明能得到很好的免疫保護(hù)效果。目前，亞單位疫苗也已成為研究的熱點(diǎn)之一。

3.2.3利用miRNA干擾PRRSV的復(fù)制來防控藍(lán)耳病 MicroRNA (miRNA) 是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，可在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。越來越多的研究表明，miRNA在調(diào)節(jié)宿主與病原體相互作用和先天性免疫方面具有重要作用。在抗病毒感染和復(fù)制方面，宿主細(xì)胞miRNA的作用也不可或缺：一方面，miRNA通過序列完全或部分互補(bǔ)配對的方式，直接結(jié)合在病毒的基因組上，降解轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制蛋白表達(dá)進(jìn)而起到基因沉默的作用；另一方面，miRNA也可間接作用于某個細(xì)胞成分，常?？梢云鸬接绊懠?xì)胞內(nèi)通路和調(diào)節(jié)先天性免疫應(yīng)答的功效，從而間接干擾病毒的生命周期。目前，有關(guān)miRNA在干擾PRRSV復(fù)制方面的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，相信在不遠(yuǎn)的將來一定會給藍(lán)耳病的防控帶來新的思路。

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