高效液相色譜法同時測定復(fù)雜食品基質(zhì)中8種合成色素的含量

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(河北出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心保定分中心, 保定 071051)

近年來,一些食品生產(chǎn)廠商為了提高食品的商業(yè)價值,利用合成色素即人工色素對食品進行著色,使其更加鮮艷美觀,促進消費[1-10]。然而,幾乎所有的合成色素都不能向人體提供營養(yǎng)物質(zhì),反而危害人體健康。合成色素多以苯、甲苯、萘等化工產(chǎn)品為原料,經(jīng)過一系列有機反應(yīng)而成,長期低劑量攝入會導(dǎo)致生育力下降、畸胎,影響兒童智力發(fā)育,引發(fā)兒童過激行為。合成色素還會在體內(nèi)轉(zhuǎn)換成致癌物質(zhì),特別是偶氮類化合物的致癌作用更為明顯。但由于合成色素價格低廉,著色力強,超標使用的現(xiàn)象屢見不鮮[11-13]。國家標準GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中規(guī)定了各類食品中各種色素的使用限量,檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅禁用于肉制品,誘惑紅限用于西式火腿類、肉灌腸類和可食用動物腸衣類食品。

目前,高效液相色譜法是合成色素的主要檢測方法,由于傳統(tǒng)方法檢測時間長,工作量大,一些復(fù)雜基質(zhì)如肉腸類、茶葉、硬糖類樣品經(jīng)常出現(xiàn)回收率低、檢測結(jié)果不穩(wěn)定、存在雜峰干擾的現(xiàn)象。本工作采用固相萃取-高效液相色譜法同時測定復(fù)雜基質(zhì)中的檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、酸性紅、赤蘚紅、亮藍等8種合成色素的含量,為食品中多種易超標合成色素提供快速的檢測方法。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

島津LC-20A型高效液相色譜儀,配島津LC-20A系列真空脫氣機,自動進樣器和二極管陣列檢測器(PDA);ProElut PWA-2固相萃取柱(150 mg/6 mL)。

0.02 mol·L-1乙酸銨溶液:稱取乙酸銨1.54 g,加少量水溶解,轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中,用水定容,用0.45 μm濾膜過濾。

提取溶劑:移取乙醇30 mL,乙腈30 mL,甲醇30 mL,氨水10 mL,混勻。

莧菜紅、胭脂紅、檸檬黃、日落黃、亮藍標準溶液,質(zhì)量濃度均為0.500 g·L-1,誘惑紅、赤蘚紅標準溶液,質(zhì)量濃度均為1.00 g·L-1。

酸性紅標準品純度為93.5%,甲酸、甲醇、乙腈為色譜純,無水乙醇、氨水為分析純,乙酸銨為優(yōu)級純;試驗用水為一級水。

1．2 儀器工作條件

Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫35 ℃;流動相A為乙腈,B為0.02 mol·L-1乙酸銨溶液,流量1.0 mL·min-1;檢測波長254 nm;進樣量20 μL。梯度洗脫程序:0 min時,A為5%;20 min時,A為30%;30 min時,A為37%;31～40 min時,A為5%。

1．3 試驗方法

稱取樣品1.000 g至50 mL離心管中,加入提取溶劑20 mL,漩渦振蕩2 min,超聲提取10 min后,以6 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心2 min,收集上清液。取下層殘留物,加入提取溶劑10 mL,漩渦振蕩2 min,超聲提取15 min后,以6 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心2 min,收集上清液。將下層殘留物用10 mL提取溶劑按照上一步驟重復(fù)提取1次,合并3次上清液。將上清液在40 ℃水浴條件下,減壓蒸發(fā)濃縮至約3 mL,加入水2 mL,混勻,用甲酸將pH調(diào)至5.0左右,待ProElut PWA-2小柱凈化。

ProElut PWA-2小柱使用前依次用甲醇5 mL活化、水5 mL平衡。將全部待凈化液上樣至小柱,流量控制在0.05 mL·s-1以內(nèi),棄去流出液。依次加入2%(體積分數(shù),下同)甲酸溶液5 mL、水5 mL和甲醇5 mL沖洗小柱,棄去流出液,并用洗耳球吹干。最后加入氨水-甲醇(15+85)溶液5 mL洗脫小柱,收集洗脫液。將洗脫液在50 ℃下氮吹至約0.5 mL,用0.02 mol·L-1乙酸銨溶液定容至1 mL,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,在儀器工作條件下進行測定。

2 結(jié)果與討論

2．1 提取方法

肉制品基質(zhì)復(fù)雜,樣品中含有大量的脂肪和水溶性蛋白質(zhì)。茶葉成分種類繁多,有水、蛋白質(zhì)、氨基酸、咖啡因、多元酚類、碳水化合物、脂質(zhì)、礦物質(zhì)、植物色素、維生素等,脂質(zhì)、植物色素等難溶于水的物質(zhì)增加了提取難度。硬糖是由各類調(diào)料和芳香化合物調(diào)制而成,生產(chǎn)過程中添加了大量色素。同時檢測復(fù)雜基質(zhì)中的8種合成色素時,采用合適的提取溶劑對保證結(jié)果準確尤為重要。檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、酸性紅、赤蘚紅、亮藍等偶氮類化合物易溶于水,難溶于乙醇,不溶于油脂。而蛋白質(zhì)為水溶性,直接用水提取極易造成系統(tǒng)的污染,因此選用有機溶劑提取,將樣品中的脂肪除去。蛋白質(zhì)不溶于乙醇,在溶劑中加入乙醇,可以將不溶于醇的蛋白質(zhì)除去,將色素分離出來。由于色素在乙醇中的溶解度很低,加入少量氨水,提高色素的溶解度,使色素更容易被提取。因此,試驗選用乙醇-乙腈-甲醇-氨水混合溶液作為提取溶劑。

2．2 固相萃取柱的選擇

提取劑可同時將色素和某些脂溶性成分提取出來,形成雜質(zhì)干擾,影響基線的穩(wěn)定性,因此選擇固相萃取小柱進行凈化。試驗考察了3種不同分離模式的固相萃取小柱(Waters oasis HLB固相萃取柱、ProElut PLS固相萃取柱和ProElut PWA-2固相萃取柱)。Waters oasis HLB柱以親水親脂的水可浸性共聚物為固定相,吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮按一定比例聚合而成的大孔共聚物,保留機理為反相。ProElut PLS柱兼具親水基團(吡咯烷酮基團)和疏水基團(二乙烯基苯),屬于反相吸附劑,對極性化合物和非極性化合物均有較好的保留,具有親水親脂平衡的特性,對于堿性化合物有很好的分離效果。ProElut PWA-2柱的固定相為含親水基團的聚苯乙烯、二乙烯基苯的共聚物,作用基團為哌嗪基團、苯基、乙烯基和吡咯烷酮基,保留機理主要為陰離子交換相互作用和非極性相互作用,其次是極性相互作用,主要用于分離純化強酸性化合物,比如含有磺酸基團的化合物。

試驗發(fā)現(xiàn), Waters oasis HLB柱對莧菜紅、亮藍和赤蘚紅的回收率較低,赤蘚紅回收率僅為13%。而對比ProElut PLS柱與ProElut PWA-2柱發(fā)現(xiàn),ProElut PWA-2柱的回收率較高,可能是由于ProElut PWA-2柱的固定相是混合型弱陰離子交換吸附劑,具有弱陰離子交換和反相保留兩種模式,可以有效去除干擾,提高回收率。8種合成色素中,除赤蘚紅為苯甲酸鈉結(jié)構(gòu)外,其他均為苯磺酸鈉結(jié)構(gòu),含有磺酸基,屬于強陰離子化合物,利用弱陰離子交換形成保留。而赤蘚紅回收率偏低可能是由于它的苯甲酸鈉結(jié)構(gòu)相對于苯磺酸鈉結(jié)構(gòu)保留性偏弱。因而試驗采用ProElut PWA-2固相萃取柱。

2．3 色譜條件的選擇

試驗選取了乙腈-水、乙腈-乙酸銨、甲醇-乙酸銨等不同流動相進行樣品分析,結(jié)果表明:乙腈和水為流動相無法使合成色素分離,甲醇-乙酸銨無法使部分合成色素有效分離,而乙腈-乙酸銨體系可以使8種合成色素得到有效分離,峰形最佳。進一步選用0.01,0.02,0.03,0.04,0.05 mol·L-1乙酸銨溶液進行比較,發(fā)現(xiàn)使用0.02 mol·L-1乙酸銨溶液時,8種合成色素的分離效果達到最好,當乙酸銨溶液濃度再增大時,峰形和分離效果無明顯改善,因此試驗選用乙腈-0.02 mol·L-1乙酸銨溶液作為流動相體系。8種合成色素的混合標準溶液的色譜圖見圖1。

圖1 8種合成色素的混合標準溶液的色譜圖Fig. 1 Chromatogram of the mixed standard solution of eight kinds of synthetic colorants

選取空白豬大腸樣品,添加8種合成色素的標準品,按試驗方法制備樣品溶液,其色譜圖見圖2。

圖2 空白樣品加標后的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of blank sample after addition with standard substances

2．4 標準曲線與檢出限

分別取8種色素的標準溶液或標準品,用水配制成0.25,2.0,5.0,10.0,15.0 mg·L-1的混合標準溶液系列,按試驗方法進行測定,分別以8種物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標,相應(yīng)的峰面積為縱坐標繪制標準曲線,得到線性范圍、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

以3倍信噪比計算檢出限(3S/N),結(jié)果見表1。

2．5 精密度和回收試驗

選取空白豬大腸樣品,分別加入8種合成色素方法檢出限濃度的1倍、2倍、10倍的標準溶液于樣品中,按試驗方法處理樣品并平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表2。

由表2可知:加標回收率在84.6%～99.0%之間,RSD在1.4%～2.5%之間,完全符合檢測要求。

表1 線性參數(shù)與檢出限Tab. 1 Linearity parameters and detection limits

表2 精密度與回收試驗結(jié)果(n=6)Tab. 2 Results of tests for precision and recovery(n=6)

同時選取空白茶葉、硬糖樣品進行精密度和回收試驗,回收率和精密度也均滿足檢測要求。

本方法利用固相萃取柱對色素進行富集和凈化,采用高效液相色譜法同時測定復(fù)雜食品基質(zhì)中的8種合成色素,縮短了檢測時間,提高了工作效率,對復(fù)雜基質(zhì)能有效提高檢測的準確性,可用于測定各種復(fù)雜基質(zhì)樣品中的多種添加合成色素。

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