菊花的氣相色譜指紋圖譜及其系統(tǒng)聚類分析

, 麗麗

(1. 杭州職業(yè)技術學院 臨江學院, 杭州 310018; 2. 浙江工業(yè)大學 化學工程學院, 杭州 310014)

菊花[1]為菊科植物菊的干燥頭狀花序,作為藥材按產(chǎn)地不同,分為亳菊、滁菊、貢菊、杭菊。菊花性甘、苦,微寒,主要含有萜類、黃酮類、有機酸類、生物堿類等活性物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理研究表明,菊花具有廣泛的生物活性,如抗炎、抗氧化性、抗腫瘤、保護心血管等作用[2]。

中藥的療效既不是任何單一活性成分的作用,也不是多種成分活性的簡單加和,而是諸多成分間的協(xié)同作用。中藥的這種非線性特征需要宏觀的、非線性的、多因素的質(zhì)量控制模式,指紋圖譜就是適應這一特點的一種質(zhì)量控制模式[3],其作用是反映具有復雜成分中藥內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。菊花為藥食同源植物,有關菊花指紋圖譜研究的報道中多采用高效液相色譜法[4]、氣相色譜法[5]、光譜法[6]等,這些方法均為菊花的質(zhì)量評價提供了較好的參考。但這些方法的前處理方法,如水蒸氣蒸餾法、浸泡法、超聲溶劑萃取法等,均存在需要樣品量多、過程復雜、損失較大等問題。

固相微萃取(SPME)是20世紀90年代出現(xiàn)的一種無溶劑樣品前處理技術,它集采集、萃取、濃縮、進樣于一體,能方便地與氣相色譜等聯(lián)用,快速有效地分析樣品中的痕量有機物,近年來被成功應用于藥材的指紋圖譜分析。周海梅等[7]采用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法(HS-SPME-GC-MS)鑒定貢黃菊、貢白菊揮發(fā)性成分。宋青坡等[8]建立了野菊花揮發(fā)油成分的氣相色譜指紋圖譜,為野菊花整體質(zhì)量評價提供依據(jù)。系統(tǒng)聚類的核心思想是將各個樣品各看成一類,然后規(guī)定類與類之間的距離,選擇距離最小的一對合并成新的一類,計算新類與其他類之間的距離,再將距離最近的兩類合并,這樣每次減少一類,直至所有的樣品合為一類為止。文獻[9]應用系統(tǒng)聚類分析比較了不同產(chǎn)地鐵皮石斛的裂解氣相色譜指紋圖譜。

本工作收集市售亳州、滁州、桐鄉(xiāng)、黃山等4個產(chǎn)地12個菊花樣品,采用HS-SPME-GC建立其指紋圖譜,指認指紋圖譜中的特征峰,經(jīng)質(zhì)譜分析比對NIST08譜庫,結(jié)合相關文獻對主要揮發(fā)性成分進行鑒定,采用系統(tǒng)聚類分析法對不同產(chǎn)地的12批次菊花樣品的HS-SPME-GC指紋圖譜進行分類比較,最后用指紋圖譜對2個市售菊花產(chǎn)品進行產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量評價。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;Agilent 7890A型氣相色譜儀,配氫火焰離子檢測器(FID);Supelco型手動固相微萃取裝置,配65 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)/二乙烯基苯(DVB),85 μm鄰苯二甲酸酐(PA),100 μm PDMS萃取頭;Agilent 15 mL頂空瓶;CP 224S型分析天平;JP-500C型中藥粉碎機;SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件。

樣品S1～S3產(chǎn)地為安徽亳州,樣品S4～S6產(chǎn)地為浙江桐鄉(xiāng),樣品S7～S9產(chǎn)地為安徽歙縣,樣品S10～S12產(chǎn)地為安徽滁州。從藥材市場購買2個質(zhì)量一般的菊花樣品作為待測樣品(U1和U2)。

1．2 儀器工作條件

1) 氣相色譜條件 RESTEK Rtx-1701石英毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);進樣口溫度250 ℃;不分流模式;載氣為氦氣,流量1 mL·min-1;FID溫度300 ℃。柱升溫程序:初始溫度35 ℃,保持2 min;以5 ℃·min-1速率升溫至200 ℃,保持15 min。

2) 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源,電離能量70 eV,溫度230 ℃;掃描范圍m/z50～550;傳輸線溫度280 ℃。

1．3 試驗方法

取干燥菊花樣品10 g,用中藥粉碎機研磨成粉,過0.125 mm篩,裝瓶,備用。

HS-SPME操作過程:稱取粉碎后樣品0.50 g,裝入20 mL螺口頂空樣品瓶中,用聚四氟乙烯隔墊密封,于80 ℃水浴恒溫預熱30 min,將固相微萃取器的萃取頭通過聚四氟乙烯隔墊插入樣品瓶中,頂空吸附30 min,在氣相色譜進樣口250 ℃下解吸5 min后,經(jīng)氣相色譜和質(zhì)譜進行分析。

1．4 菊花的HS-SPME-GC指紋圖譜的建立

參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》,分別取12個菊花樣品S1～S12、2個市售菊花樣品U1～U2,按試驗方法進行分析,記錄色譜圖。12個樣品及2個市售菊花樣品的22個共有峰相對于參照峰的面積比得到14×22階原始數(shù)據(jù)矩陣(見表2中的S1～S12峰面積比值部分,U1～U2計算方法同表2),采用SPSS 16.0軟件包中的聚類分析程序?qū)Υ司仃囘M行聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2．1 HS-SPME-GC試驗條件的選擇

萃取溫度、萃取時間、萃取頭的選擇對試驗結(jié)果十分重要。萃取溫度過高、萃取時間過長,會縮短萃取頭的使用壽命,浪費能源、耗材;相反,萃取溫度過低、萃取時間過短,萃取物質(zhì)少,峰的強度低;而在適當?shù)臏囟?、時間區(qū)間內(nèi),峰的數(shù)量和強度均適宜。試驗考察了萃取溫度與峰面積的關系,結(jié)果表明:總峰面積隨著萃取溫度的升高而顯著增大,80 ℃時到達最大值,90 ℃趨于平緩。因此,試驗選擇80 ℃作為萃取溫度。試驗考察了萃取時間與峰面積的關系,結(jié)果表明:總峰面積隨著萃取時間的增加而迅速增大,頂空時間30 min時到達最大值,說明30 min時SPME的吸附已經(jīng)達到平衡。因此,試驗選擇萃取時間為30 min。

試驗考察了65 μm PDMS/DVB、85 μm PA、100 μm PDMS等3種萃取頭的萃取效果,結(jié)果表明:采用65 μm PDMS/DVB萃取頭能檢出48種化合物,而采用85 μm PA萃取頭能檢出41種化合物,采用100 μm PDMS萃取頭能檢出45種化合物;采用65 μm PDMS/DVB萃取頭時,色譜分析響應值最高。因此,試驗選擇65 μm PDMS/DVB萃取頭。

2．2 菊花HS-SPME-GC指紋圖譜的建立

2．2．1 菊花HS-SPME-GC指紋圖譜參照峰與共有峰的選擇

按試驗方法測定12個菊花樣品,圖1為S5樣品的色譜圖。

圖1 S5菊花樣品HS-SPME-GC圖譜Fig. 1 HS-SPME-GC chromatogram of sample S5

由圖1可知:菊花頂空固相微萃取產(chǎn)生近50個色譜峰,選擇共有峰作為考察對象,即保留時間為35 min內(nèi)的1～22號峰。12個樣品的共有峰面積分別占總峰面積的80%以上。選擇保留時間為25.57 min的9號峰為參照峰,此峰為有效成分色譜峰、相對強度較強且較穩(wěn)定。

2．2．2 菊花HS-SPME-GC指紋圖譜的建立

根據(jù)12個菊花樣品的色譜圖計算22個共有峰的相對保留時間α(各組分的調(diào)整保留時間與峰9的調(diào)整保留時間的比)和峰面積百分比S(該組分峰面積占共有峰面積之和的百分比),以及各樣品與S5的S值的最大差值[ΔS(Max)],結(jié)果見表1。

表1 12個菊花樣品的HS-SPME-GC指紋圖譜數(shù)據(jù)Tab. 1 Data of HS-SPME-GC fingerprints of 12 chrysanthemum samples

表1(續(xù))

依據(jù)指紋圖譜的技術要求,由表1可知:當α為0.906,1.000,1.103,1.172時,10%

2．2．3 菊花化學成分MS分析

結(jié)合文獻[11-14]以及質(zhì)譜分析可知,菊花化學成分大部分為倍半萜烯烴及其氧化衍生物。表1中峰3為樟腦,峰4為龍腦,峰9為菊酮,峰1,5～8和峰10～12為倍半萜烯烴,分別為α-蒎烯、β-欖香烯、丁香烯、石竹烯、α-姜黃烯、β-石竹烯、β-金合歡烯和β-紅沒藥烯;峰18～22為倍半萜的氧化衍生物,分別為桉葉醇、雪松醇、桉葉烯醇、杜松醇、紅沒藥醇。

2．3 菊花樣品的系統(tǒng)聚類分析

對14(12個樣品及2個市售菊花樣品)×22(22個共有峰的相對峰面積)階原始數(shù)據(jù)矩陣,采用SPSS 16.0軟件包中的聚類分析程序?qū)Υ司仃囘M行聚類分組。在方法上對數(shù)據(jù)變量作均數(shù)為1的轉(zhuǎn)換,使其標準化,采用歐氏距離作為間隔尺度變量,每兩樣本以類間平均連接法連接,可輸出系統(tǒng)聚類分析圖。

圖2為樣品的系統(tǒng)聚類分析圖,橫坐標為臨界值,即類間的距離,縱坐標為樣品名。臨界值越小,表示譜圖越相似。

圖2 菊花樣品的系統(tǒng)聚類分析圖Fig. 2 Hierarchical cluster analysis diagram of chrysanthemum samples

由圖2可知:當臨界值介于1至15時,來源于4個產(chǎn)地的樣品S1～S3,樣品S4～S6,樣品S7～S9和樣品S10～S12分為4類,反映了這4類菊花的不同產(chǎn)地來源。當臨界值為16時,源于安徽歙縣(經(jīng)度118°44′,緯度29°88′)的樣品S7～S9和安徽亳州(經(jīng)度115°47′,緯度33°52′)的樣品S1～S3聚為一類。當臨界值介于16至20時,源于安徽滁州(經(jīng)度118°31′,緯度32°33′)的樣品S10～S12與浙江桐鄉(xiāng)(經(jīng)度120°32′,緯度30°38′)的樣品S4～S6從兩類聚為一類。當臨界值為25時,4個產(chǎn)地的菊花聚為一類,表明了地域的差別。另外,2個市售菊花樣品U1和U2,經(jīng)相同聚類分析方法,可以判定樣品U1產(chǎn)地為浙江桐鄉(xiāng),樣品U2產(chǎn)地為安徽滁州。由樣品U1與樣品S4～S6有一點距離,說明市售菊花樣品質(zhì)量稍差,經(jīng)專家鑒定為一級杭白菊。結(jié)果表明,系統(tǒng)聚類分析法既能比較全面、綜合地反映不同產(chǎn)地菊花HS-SPME-GC圖譜之間的差異,也能表明相鄰地域之間的菊花樣品之間的相似,還能對市售菊花產(chǎn)品進行產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量評價。

本工作采用HS-SPME-GC建立4個產(chǎn)地12個菊花樣品和2個市售菊花樣品的氣相色譜指紋圖譜,并進行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果表明,所建立的方法既能反映菊花HS-SPME-GC譜圖之間的相似關系又能反映不同產(chǎn)地之間的差異,可對市售菊花產(chǎn)品進行產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量評價。

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