鼻咽癌篩查中三種EB病毒抗體檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值分析

付 麗，李延忠

（1.山東電力中心醫(yī)院耳鼻喉科，山東 濟(jì)南 250000；2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000）

鼻咽癌（carcinoma of nasopharynx，NPC）為臨床常見惡性腫瘤，來源于上皮細(xì)胞，其發(fā)病位置主要有鼻咽腔側(cè)壁與鼻咽腔頂部。本病屬于全球性惡性腫瘤，但在北美、東南亞等地高發(fā)，同樣也是我國江蘇、廣西、廣東、湖南、香港及福建等沿海地區(qū)高發(fā)腫瘤[1]。本病作為頭頸部惡性腫瘤轉(zhuǎn)移率與侵襲性最高，早期無典型癥狀，確診后多為晚期，有較差的預(yù)后，目前治療以放射為主，輔助化療，一般不手術(shù)，而晚期鼻咽癌患者存活率僅14%[2]，療效差，因此臨床提出預(yù)防與治療鼻咽癌的關(guān)鍵在于篩查與早期診斷鼻咽癌高發(fā)地區(qū)人群，可提升NPC患者存活率。當(dāng)前臨床已經(jīng)明確NPC發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)于EB病毒（（Epstein Barr，EBV），其屬于皰疹病毒科，為臨床認(rèn)識(shí)較早的關(guān)聯(lián)于腫瘤的病毒，外國學(xué)者首次于1966年發(fā)現(xiàn)其密切關(guān)聯(lián)于NPC。研究稱EBV完整病毒可導(dǎo)致機(jī)體鼻咽黏膜上皮細(xì)胞癌變，而在鼻咽癌細(xì)胞中不僅EB病毒基因組存在，而且還包括多類EB病毒特異性抗原[3]。近年來分子生物學(xué)技術(shù)逐漸發(fā)展，臨床基于分子水平角度不斷探討研究鼻咽癌與EBV間存在的關(guān)聯(lián)，且提出檢測(cè)NPC患者血清EBV抗體水平可有效篩查與診斷NPC。以往臨床多采用IE與間接免疫熒光法（IIF）檢測(cè)EA與VCAIgA抗體，步驟繁瑣，主觀因素影響較大，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化與自動(dòng)化，難以開展質(zhì)量控制，因此臨床逐漸采用ELISA定量方法檢測(cè)EBV相關(guān)抗體。現(xiàn)詳述檢測(cè)Rta/IgG抗體、EA/IgA抗體及VCA/IgA抗體對(duì)篩查NPC的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2017年1月齊魯醫(yī)院門診收治的鼻咽癌患者14例，均經(jīng)鼻咽活檢病理檢查確診，尚未接受治療，設(shè)為鼻咽癌組，其中男性12例，女性2例，年齡為24～75歲，平均年齡為（43.8±8.5）歲。選取同期于我院門診就診的非鼻咽癌但表現(xiàn)出鼻咽部癥狀的患者320例，設(shè)為非鼻咽癌組，有鼻咽部癥狀的其他鼻咽部疾病如鼻炎、鼻竇炎、慢性咽炎、中耳炎、耳鳴、鼻出血等，排除頭頸部其他惡性腫瘤。其中男性214例，女性106例，年齡為18～78歲，平均年齡為（41.6±7.6）歲。選取同期于我院體檢的健康人500例設(shè)為健康組，其中男性342例，女性158例，年齡為18～72歲，平均年齡為（40.6±6.9）歲。

1.2 檢測(cè)方法

于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集3組研究對(duì)象靜脈血4～5 mL，常規(guī)放置30 min，血液凝固后開展離心處理，3000 r/min為離心速度，持續(xù)10 min，在-20℃冰箱中保存上層血液后待檢。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附劑試劑盒（來自北京同昕生物技術(shù)有限公司），應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（EILSA）檢測(cè)Rta/IgG抗體，應(yīng)用EILSA試劑盒（來自德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司）檢測(cè)EA/IgA抗體及VCA/IgA抗體，嚴(yán)格按照試劑規(guī)定要求開展操作，陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：S/CO值在1.0及其以上代表Rta/IgG陽性，S/CO值在1.1及其以上代表EA/IgA及VCA/IgA陽性。同時(shí)檢測(cè)EBV DNA：將乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血血漿分離出來，采用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒。EBV DNA檢測(cè)方法為熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR），將病毒拷貝數(shù)計(jì)算出來，用湖南圣湘生物科技有限公司生產(chǎn)的檢測(cè)試劑盒，陽性標(biāo)準(zhǔn)為EBV DNA計(jì)數(shù)在50 copy/mL以上，低于該檢測(cè)值則判定為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件為SPSS 20.0，資料表示用n（%），卡方檢驗(yàn)處理組間陽性率比較，若P＜0.05提示比較有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 3組研究對(duì)象血清EB病毒Rta/IgG抗體、EA/IgA抗體及VCA/IgA抗體陽性率比較

鼻咽癌組Rta/IgG、EA/IgA及VCA/IgA抗體檢測(cè)陽性率均明顯高于非鼻咽癌組與健康組；非鼻咽癌組VCA/IgA抗體檢測(cè)陽性率明顯高于健康組；鼻咽癌組內(nèi)VCA/IgA抗體檢測(cè)陽性率明顯高于EA/IgA與Rta/IgG抗體；非鼻咽癌組EA/IgA檢測(cè)陽性率明顯低于Rta/IgG、VCA/IgA；健康組EA/IgA檢測(cè)陽性率低于Rta/IgG與VCA/IgA，比較均有顯著性差異（P＜0.05）。見表1。

表1 3組研究對(duì)象血清EB病毒EBNAI/IgA抗體、EA/IgA抗體及VCA/IgA抗體陽性率比較 [n（%）]

2.2 3種EB病毒抗體篩查檢測(cè)鼻咽癌的臨床價(jià)值比較

VCA/IgA抗體檢測(cè)靈敏度明顯高于EA/IgA、Rta/IgG，Rta/IgG也高于EA/IgA；EA/IgA抗體特異度與陽性預(yù)測(cè)值明顯高于Rta/IgG、VCA/IgA，比較均有顯著性差異（P＜0.05），見表2。

表2 3種EB病毒抗體篩查檢測(cè)鼻咽癌的臨床價(jià)值比較（n，%）

3 討 論

NPC為我國發(fā)生率較高的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球NPC案例中我國占比高達(dá)80%，且男性患者數(shù)量比女性高2～3倍[4]。當(dāng)前臨床尚未明確NPC發(fā)生機(jī)制，多認(rèn)為關(guān)聯(lián)于遺傳因素、病毒因素及環(huán)境因素。遺傳因素主要為異常的白蛋白抗原基因，世界衛(wèi)生組織證實(shí)人類腫瘤中70%～80%關(guān)聯(lián)于環(huán)境因素[5]，而體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明香煙煙霧提取物可加快EBV復(fù)制，吸煙會(huì)增加鼻咽癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，且在健康男性中參與激活EBV環(huán)節(jié)。病毒因素主要為EBV，臨床大量研究結(jié)果證實(shí)機(jī)體早期感染EBV或長(zhǎng)期反復(fù)感染會(huì)致使鼻咽部上皮永生化并加快其惡化進(jìn)程。EBV病毒屬于嗜B細(xì)胞，為皰疹病毒之一，為多種疾病誘發(fā)因素，累及多個(gè)臟器、系統(tǒng)如消化道、血液及呼吸等，研究稱EBV裂解感染狀態(tài)關(guān)聯(lián)于乳腺癌、食管癌及胃癌發(fā)生發(fā)展。

人類自然感染中EB十分普遍，水平傳播，可在被感染宿主體內(nèi)終身潛伏，EB病毒可通過口口方式進(jìn)行轉(zhuǎn)播，所以在人類群體中隱性感染者以及攜帶有EB病毒的無癥狀者是最為主要的傳染源[6]。兒童期多為原發(fā)性感染時(shí)期，主要為隱性感染，咽部上皮細(xì)胞為常見感染部位，上皮B淋巴細(xì)胞被EBV侵襲后沿著淋巴系統(tǒng)攜帶病毒進(jìn)入血液循環(huán)中，且將病毒性抗原釋放出來，T淋巴細(xì)胞將抗原分子識(shí)別出后將其標(biāo)志EBV-淋巴細(xì)胞破壞，但與此同時(shí)咽部上皮又會(huì)出現(xiàn)新感染EBV-B淋巴細(xì)胞，宿主被反復(fù)感染后EBV攜帶狀態(tài)得以維持。有學(xué)者提出B淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)EBV的原發(fā)性感染及病毒持續(xù)狀態(tài)[7]。細(xì)胞被EBV感染后若釋放病毒為產(chǎn)病毒性感染，反之為非產(chǎn)病毒性感染，后者有兩種形式，即潛伏性感染與惡性轉(zhuǎn)化，潛伏性感染主要經(jīng)過如下過程：細(xì)胞內(nèi)有整個(gè)病毒基因組潛伏，經(jīng)由DNA多聚酶保留復(fù)制于早s期；基因組表達(dá)形式并非整體，而是基因有限部分；基因組激活關(guān)鍵在于表達(dá)BRLF1與BLIF1基因[8]。當(dāng)前臨床提出NPC患者感染EBV的主要機(jī)制為受體學(xué)說，即EB病毒經(jīng)由受體pIgR或CR2介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞[9]。在EB病毒抗體陽性與正常鼻咽上皮細(xì)胞鼻咽活檢組織中均無EB病毒，而在鼻咽原位癌中有單克隆病毒基因組出現(xiàn)，由此推測(cè)惡性細(xì)胞克隆擴(kuò)展前EB病毒感染已經(jīng)發(fā)生。

鼻咽癌治療效果取決于早期的檢測(cè)，而EBV血清學(xué)的篩查能夠有效明確鼻咽癌的高危人群[10]。羅耀凌等人臨床研究中，疾病對(duì)照組的病毒Rta-IgG與EAIgA以及DNA的陽性率和健康對(duì)照組的之間數(shù)據(jù)比較無顯著差異，這一結(jié)果表明了鼻咽癌在確診之前患者的血清中便存在高滴度各類型EBV抗體、抗原，因此對(duì)EBV相關(guān)抗原抗體進(jìn)行檢測(cè)對(duì)于鼻咽癌患者血清學(xué)診斷具有重大意義[11]。以往臨床檢測(cè)EBV抗體的金標(biāo)準(zhǔn)為IIF，但需使用熒光顯微鏡，使用受限。而后曾毅于1982年用IE法檢測(cè)VCA-IgA，臨床逐漸將其作為常規(guī)方法，但其操作仍然比較繁瑣，且主觀影響因素較多；而ELISA操作簡(jiǎn)易，客觀性高，重復(fù)性好，因此被臨床廣泛使用。在EBV抗體中VCA為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，合成于增殖周期，有較強(qiáng)的免疫抗原性。研究稱絕大多數(shù)NPC患者血清為VCA IgA陽性[12]，因此國內(nèi)將其作為篩查與診斷NPC的常規(guī)手段，可提升NPC早期診斷率。本組結(jié)果表明VAC-IgA檢測(cè)NPC的靈敏度為92.9%，特異性為89.6%，準(zhǔn)確度為90.1%。該抗體靈敏度較高可能導(dǎo)致部分假陽性，加大臨床工作量，而陽性患者中90%一生中可能無NPC患病風(fēng)險(xiǎn)，因此確診或排除陽性患者還需開展大量工作，防止受檢者承受巨大心理與精神壓力，經(jīng)常復(fù)查也會(huì)增加其經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[13]。但盡管VCA有上述弊端，臨床還是將其作為篩查NPC的經(jīng)典指標(biāo)。

裂解復(fù)制期EBV會(huì)表達(dá)EA，有局限型與彌漫型兩種，其發(fā)生代表體內(nèi)開始EBV復(fù)制[14-15]。本組EAIgA抗體檢測(cè)靈敏度為50.0%，特異性為99.9%，準(zhǔn)確度為97.1%，，由此可知其靈敏度低，在其他腫瘤與正常人體內(nèi)幾乎不會(huì)被檢出，NPC患者抗體滴度低于1.5時(shí)也難以顯示陽性，因此部分患者可能漏診，這是其最大弊端。因此臨床在診斷NPC或篩查高危人群時(shí)多聯(lián)合EA與VCA，兩種均為陽性多數(shù)可確診。RTA蛋白為EBV從潛伏期向裂解期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)控因子，可相繼表達(dá)系列裂解早期基因，最終將EBV裂解干擾誘發(fā)。研究稱在不同人群中Rta/IgG均有所表達(dá)，但程度不一，如鼻咽癌組陽性率為81.3%，肝癌組為10.5%，胃癌組為10.5%，肺癌組為10.5%，乳腺癌組為20.7%，宮頸癌組為15.8%[16]，由此可知鼻咽癌組最高，因此在篩查NPC患者中使用Rta/IgG抗體檢測(cè)效果較好，可對(duì)鼻咽癌癌變發(fā)生最早時(shí)刻予以捕捉，有較高的特異性，為臨床篩查鼻咽癌的首選方式。本組結(jié)果表明Rta/IgG檢測(cè)NPC的靈敏度為85.7%，特異性為93.3%，準(zhǔn)確度為92.7%。當(dāng)前臨床認(rèn)為Rta/IgG表達(dá)無關(guān)于NPC臨床分期[17]，但尚未明確其表達(dá)與NPC發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及浸潤關(guān)系，需臨床深入探討[18]。

綜上所述，Rta準(zhǔn)確度、靈敏度及特異度均較高，VCA靈敏度、特異度較高，EA特異度高但靈敏度較低，相比而言VCA、Rta篩查NCP臨床價(jià)值較高，可結(jié)合實(shí)際選擇聯(lián)合檢測(cè)法，避免漏診。

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