桑葚多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠免疫功能低下的調(diào)節(jié)作用

駱 新， 王 忠， 朱虎虎， 孫建新， 李琳琳

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 2醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 烏魯木齊 830011)

桑葚(mulberry)是桑科桑屬多年生木本植物桑樹的果實(shí)，橢圓形，長(zhǎng)1～3 cm，表面不平滑。未成熟時(shí)為綠色，逐漸成長(zhǎng)變?yōu)榘咨⒓t色，成熟后為紫紅色或紫黑色，味酸甜。其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種功能性成分，如蘆丁、花青素、白黎蘆醇、維生素及Fe、Ca等礦物元素，并含有桑葚紅色素、多糖和黃酮類物質(zhì)。桑葚有補(bǔ)肝益腎、滋陰養(yǎng)血、黑發(fā)明目、祛斑延年的功效，已經(jīng)被人們認(rèn)為是一類具有營(yíng)養(yǎng)保健功能的天然食品[1]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，桑葚具有具有良好的防癌、抗衰老、抗?jié)儭⒖共《镜茸饔?。針?duì)桑葚開展的一些藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，桑葚能升高外周白細(xì)胞，有防止環(huán)磷酰胺所致的白細(xì)胞減少、中度促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，能使衰老的T細(xì)胞得到恢復(fù)、可促進(jìn)血細(xì)胞的生長(zhǎng)，并對(duì)粒單系祖細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，在胃中能補(bǔ)充胃液的缺乏，可增強(qiáng)胃的消化力，進(jìn)入腸內(nèi)能刺激腸黏膜，使腸液分泌增多，腸的蠕動(dòng)增強(qiáng)，降低細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶活性。另有研究表明，桑葚具有抗氧化和降糖作用[2-3]，其主要活性成分為桑葚多糖(Mulberries polysaccharide,MP)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)桑葚的實(shí)驗(yàn)研究多是在活性成分提取和理化性質(zhì)的測(cè)定方面，桑葚多糖免疫調(diào)節(jié)作用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究較少。

本課題在優(yōu)化桑葚多糖提取工藝的基礎(chǔ)上，觀察多糖提取物對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫功能低下小鼠模型[4-6]的免疫調(diào)節(jié)作用，為其進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組清潔級(jí)昆明種小鼠140只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(新)2016-0002，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2016-0001。根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察目的，分2次領(lǐng)取，每次領(lǐng)取70只，分別用于臟器指數(shù)、細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)小鼠按體質(zhì)量均衡隨機(jī)分為5組，每組14只，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、MP低、中、高劑量組(0.25、0.5、1 g/kg體質(zhì)量，根據(jù)提取率計(jì)算，相當(dāng)于生藥量3.8、7.6、15.2 g/kg體質(zhì)量)。實(shí)驗(yàn)在新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心屏障實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2藥品與試劑桑葚干(mulberry) 購(gòu)于新疆吐魯番地區(qū)，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、綿羊紅細(xì)胞懸液、Hanks液(美國(guó)Hyclone公司)，環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，刀豆蛋白A(ConA)、四甲基偶氮唑藍(lán)(美國(guó)Sigma公司)，丙酮、二甲基亞砜、苯酚、乙醚(天津永晟精細(xì)化工分析純?cè)噭?，95%乙醇、無水乙醇、濃硫酸(濟(jì)南世紀(jì)通達(dá)化工分析純?cè)噭?。

1.3儀器VS-1300L-U型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),UV-2501PC 雙光束紫外分光光度計(jì)(日本島津公司),HF212UV CO2培養(yǎng)箱(上海斯高勒生物科技有限公司),SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵江蘇宏凱儀器廠,MC318 酶標(biāo)儀(上海將來實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),MoticAE31 倒置相差顯微鏡(北京瑞科中儀科技有限公司)。

1.4MP的制備和含量測(cè)定[6]將桑葚干粉碎后，準(zhǔn)確稱取桑葚粉10 g加500 mL的蒸餾水回流提取2次，每次3 h，濃縮至膏狀。再經(jīng)乙醇沉淀、離心、去蛋白、二次醇沉后干燥，總糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法，還原糖采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定，二者差值為多糖含量。計(jì)算得出該條件下桑葚多糖的提取率為5.28%。

1.5小鼠免疫功能低下模型制備及指標(biāo)測(cè)定[7-8]2次領(lǐng)取的小鼠除正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給予純凈水外，余各組小鼠按設(shè)定劑量灌胃給藥，連續(xù)灌胃給藥4 w。首次領(lǐng)取的小鼠灌胃至25 d，正常對(duì)照組小鼠按0.1 mL/10 g體質(zhì)量給予生理鹽水，余各組小鼠按80 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射給予環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠免疫低下模型，連續(xù)注射3 d。實(shí)驗(yàn)第28天，各組小鼠稱重后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，沿腹中線打開腹腔和胸腔，游離脾臟、胸腺，濾紙?zhí)幚砗蠓Q重，按每10克體質(zhì)量臟器的重量(mg)計(jì)算脾臟、胸腺指數(shù)反應(yīng)免疫功能的強(qiáng)弱；將脾臟置于盛有適量無菌Hank′s液平皿中，輕輕磨碎脾臟，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾，用Hank′s液洗2遍，1 000 r/min離心10 min。采用ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)測(cè)定脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能。用酶標(biāo)儀以570 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度(OD)值。

第2次領(lǐng)取的小鼠灌胃至23 d，正常對(duì)照組小鼠按0.1 mL/10 g體質(zhì)量給予生理鹽水，余各組小鼠按80 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)注射3 d，各組小鼠按0.2 mL/只腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為2%的綿羊紅細(xì)胞懸液進(jìn)行免疫。末次灌胃后2 h，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，3 000 r/min離心15 min后取上清，用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實(shí)驗(yàn)板內(nèi)，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5%(v/v)SRBC懸液，混勻，裝入濕潤(rùn)的平盤內(nèi)并加蓋，于37℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度，并計(jì)算血清溶血素HC50；打開腹腔游離脾臟，放在盛有Hank′s液的小平皿內(nèi)，輕輕磨碎脾臟，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank′s液洗2遍，1 000 /min離心10 min，最后將細(xì)胞懸浮在5 mL RPMI1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個(gè)/mL，用以抗體生成細(xì)胞檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1脾臟、胸腺指數(shù)測(cè)定與空白對(duì)照組小鼠比較，模型對(duì)照組小鼠胸腺指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，脾臟指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，MP中、高劑量組脾臟指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MP高劑量組胸腺指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 脾臟、胸腺指數(shù)測(cè)定

注：與空白對(duì)照組比較，#P<0.05； 與模型對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2MP對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組細(xì)胞OD值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，MP中劑量組細(xì)胞OD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MP高劑量組細(xì)胞OD值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 MP對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響

注：與空白對(duì)照組比較，#P<0.05； 與模型對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3MP對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞功能及血清溶血素水平的影響與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組抗體OD值與血清HC50水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，MP多糖中、高劑量組抗體OD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MP多糖高劑量組血清HC50顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 MP對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞功能及血清溶血素水平的影響

注：與空白對(duì)照組比較，#P<0.05； 與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

桑葚為典型的藥食兼用植物代表之一，在新疆尤其南疆地區(qū)的桑葚品種較多且種植面積較廣，是一類含有豐富的人體必需的多種功能成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。新疆雖桑椹資源豐富，但產(chǎn)品種類多為初級(jí)加工，多見于飲料、果汁、果醬等產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售，其深加工還沒有得到充分的開發(fā)利用[9]。以桑葚作為開發(fā)功能性食品及藥品的優(yōu)質(zhì)原料，意義重大，不僅能滿足市場(chǎng)對(duì)桑葚保健食品的需求促進(jìn)經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型，還能改善身體素質(zhì)、增進(jìn)健康、提高生活質(zhì)量。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明MP具有一定的抗疲勞作用[10]。

多糖廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜和植物、微生物的細(xì)胞壁中，不僅是生命有機(jī)體的重要組成成分，還具有廣泛的生物活性，如免疫調(diào)節(jié)作用等[11]。植物來源的多糖是由許多相同或不同的單糖以α-或β-糖苷鍵所組成的化合物，普遍存在于自然界植物體中，桑葚就是其中之一。本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)制備免疫功能低下小鼠模型,觀察MP多糖免疫調(diào)劑作用。結(jié)果顯示，MP可在升高胸腺、脾臟指數(shù)的同時(shí)可有效促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化功能，有效地提高抗體生成細(xì)胞功能及血清溶血素水平，可初步判定MP對(duì)免疫低下模型小鼠具有增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫功能的作用。

多糖可以通過多條途徑、多個(gè)層面對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，相關(guān)免疫實(shí)驗(yàn)證明，多糖通過激活巨噬細(xì)胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、T和B淋巴細(xì)胞、補(bǔ)體和促進(jìn)干擾素、白細(xì)胞介素生成來完成調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和改善機(jī)體的免疫功能[12-14]。但多糖在天然植物中的含量低且不易分離，更重要的是多糖的藥理作用與諸多因素有關(guān)，尤其是根據(jù)多糖的結(jié)構(gòu)表征特點(diǎn)還無法確定本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)揮作用的具體是哪種多糖組分，這也為MP調(diào)節(jié)免疫的機(jī)制研究增加了復(fù)雜性。課題組將分離、純化MP組分，進(jìn)一步開展MP免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制的研究。

[1] 張志強(qiáng)，楊清香，孫來華，等.桑葚的開發(fā)及利用現(xiàn)狀[J].中國(guó)食品添加劑，2009，31(4):65-68.

[2] 李穎，李慶典.桑葚多糖抗氧化作用的研究[J].中國(guó)釀造，2010，22(4):59-61.

[3] 趙喜蘭，桑葚.多糖提取、純化分離及其降糖作用的研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32(2)：259-260.

[4] 照弋清，羅霞，楊志榮，等.不同劑量環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)正常小鼠免疫抑制的對(duì)比研究[J].免疫學(xué)雜志，2005，21(3)：122-124.

[5] 許珂玉，柳春.五味子多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J] .中國(guó)新藥與臨床藥理，2011，22(2)：157-160.

[6] 劉勝利，黃鎖義.桑葚多糖提取方法的比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(5)：2699-2700.

[7] 賈寧，王漢，鄭晶.復(fù)方黨參提取物對(duì)環(huán)磷酰胺處理小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2011，17(17)：206-208.

[8] 邵璇，遲曉麗，周文霞，等.LW-AFC對(duì)環(huán)磷酰胺處理小鼠免疫功能的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2010,24(5):333-338.

[9] 徐玉娟，肖更生，陳衛(wèi)東，等.桑椹果汁飲料加工工藝的研究[J].食品工業(yè)科技,2001,22(1):53-55.

[10] 王忠，厲彥翔，駱新，等.桑葚多糖抗疲勞作用及其機(jī)制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012,18(17):234-236.

[11] 宋雨鴻.丹參多糖抗小鼠免疫性肝損傷及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究[D].南方醫(yī)科大學(xué),2010.

[12] 袁肖笑.黃芪多糖對(duì)蛋雞免疫功效及相關(guān)基因表達(dá)影響的研究[D].浙江大學(xué),2014.

[13] 李兵.泰山松花粉多糖和蜂膠對(duì)ALV和REV誘導(dǎo)的免疫抑制雞的免疫調(diào)理作用[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[14] 尚慶輝，解玉懷，張桂國(guó)，等.植物多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(1):49-58.