依達(dá)拉奉對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞p-ERK1/2蛋白及自噬的影響

付程凱, 李建民, 趙宏濤， 劉俊杰， 趙雅寧， 李雪梅， 梁文吉

(華北理工大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心； 2附屬醫(yī)院神經(jīng)外科； 3護(hù)理與康復(fù)學(xué)院社區(qū)護(hù)理教研室， 河北 唐山 063000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是臨床上常見的神經(jīng)外科疾病，具有極高的傷殘率和致死率。盡管目前在SAH診斷、臨床手術(shù)治療和影像放射等方面取得了進(jìn)展，SAH患者死亡率有所下降，但存活者預(yù)后情況仍不容樂觀[1]。傳統(tǒng)研究認(rèn)為SAH后的腦血管痙攣(CVS)是引起遲發(fā)性腦出血(DCI)和不良預(yù)后的主要原因。對SAH如何預(yù)防、控制已進(jìn)行大量的研究，但結(jié)果并不理想，并未有效改善患者預(yù)后。而目前研究發(fā)現(xiàn)，減少早期腦部神經(jīng)細(xì)胞的損傷和死亡是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[2]。Edaravone是一種強(qiáng)效的氧自由基清除劑，廣泛用于SAH患者的治療中。臨床研究顯示SAH患者Edaravone治療組預(yù)后頭痛癥狀和腦膜刺激征的改善明顯優(yōu)于對照組，且無不良反應(yīng)，對SAH患者有明顯腦保護(hù)作用[3]。也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Edaravone可抑制SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕其早期腦損傷[4-5]。但Edaravone在SAH的治療中具體的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚不明確。有文獻(xiàn)報(bào)道自噬在SAH后的神經(jīng)損傷與保護(hù)中起重要的作用[6]，自噬是真核細(xì)胞在生理或病理因子作用下通過自噬體和溶酶體融合的途徑對受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)進(jìn)行識別、降解的一種現(xiàn)象，是除凋亡、壞死以外的第三種細(xì)胞死亡方式[7]。目前研究認(rèn)為自噬是一把雙刃劍，適度的自噬具有神經(jīng)保護(hù)作用，而過度激活的自噬可能加速神經(jīng)細(xì)胞的死亡。關(guān)于Edaravone是否可以調(diào)控SAH后自噬的表達(dá)，目前未見報(bào)道。自噬的激活及調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，涉及PIK3、MAPK、ERK1/2、JNK和P38等多條信號通路[8]。本研究擬選擇ERK1/2信號通路，觀察Edaravone對SAH后神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響，并探討其可能的分子途徑。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量350～450 g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(京)2009-003]。動(dòng)物房溫度 24～26℃，相對濕度40%～60%，飼養(yǎng)期間大鼠自由進(jìn)食水，保證充足的飼料和飲水，大鼠適應(yīng)環(huán)境1 w后開始實(shí)驗(yàn)。利用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血模型組(SAH組)、Edaravone治療組(Edaravone組)、ERK1/2抑制劑干預(yù)組(U0126組)，每組10只，術(shù)前禁食水12 h。

1.2主要試劑和儀器兔抗beclin-1單克隆抗體(美國Abcam公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，二甲亞砜溶劑(DMSO，美國Sigma公司)，GADPH(武漢博士德生物工程有限公司)，大鼠腦立體定位儀(上海奧爾科特生物科技有限公司)，OLYMPUS攝像顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，圖像采集及分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué))，酶標(biāo)儀(北京普天新橋技術(shù)有限公司)，電泳儀(北京東方儀器廠)，電轉(zhuǎn)槽(瑞典Phmarcia公司)，Gel-Doc凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，PBS緩沖液，枸櫞酸鹽緩沖液。

1.3SAH大鼠模型制作及給藥方法動(dòng)物模型的制備：采用血管內(nèi)穿刺[9]的方法復(fù)制SAH模型,大鼠用質(zhì)量濃度為100 g/L的水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸部剃毛，消毒，沿頸部中線剪開暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉。血管夾阻斷頸外動(dòng)脈，于血管夾近端剪斷頸外動(dòng)脈；將4-0單股尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，從頸總動(dòng)脈分叉開始，刺破大腦中動(dòng)脈和大腦前動(dòng)脈分叉處，停留15 s撤出，縫合傷口。Sham組在穿刺線刺入時(shí)感到阻力退出，不刺破大腦中動(dòng)脈和大腦前動(dòng)脈分叉，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

麻醉清醒后，單籠飼養(yǎng)。Edaravone組通過腹腔給藥干預(yù)，常規(guī)SAH造模術(shù)后以5 mg/kg給予Edaravone腹腔注射，12 h后重復(fù)給藥1次，直至24 h處死。U0126組于造模前30 min前經(jīng)尾靜脈注射U0126，給藥劑量為0.05 mg/kg，Sham組與SAH組注射等體積生理鹽水。

1.4HE染色每組隨機(jī)選取5只大鼠，在模型制造成功后24 h處死，用4%多聚甲醛灌注然后取腦，在30 min內(nèi)及時(shí)固定，用酒精做脫水劑脫水透明；常規(guī)石蠟包埋，切片，貼片；梯度酒精水化，脫蠟染色；脫水透明，滴加中性樹膠，加蓋玻片，封固切片。每只大鼠海馬CA1區(qū)取6個(gè)不完全重疊的視野，在光學(xué)顯微鏡(400倍)下觀察視野內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)。應(yīng)用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)觀察計(jì)數(shù)高位視野下的存活與壞死神經(jīng)細(xì)胞數(shù)。

1.5免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本采集同HE染色，切片常規(guī)脫蠟、水化，3%過氧化氫封閉10 min，高壓熱修復(fù)抗原90 s，分別滴加磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、LC3-Ⅱ及beclin-1抗體(1∶200稀釋)，濕盒中37℃孵育30 min，然后滴加二抗(1∶400)，37℃恒溫箱孵育40 min，DAB顯色、脫水、透明，中性樹膠封片，于400倍光鏡下觀察并攝片，每張切片在海馬CA1區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)視野，運(yùn)用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)并測量平均A值，對結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果Sham組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常且有序，數(shù)量較多，核仁清晰可見，胞核未固縮破裂。同Sham組比較，SAH組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞變性、水腫、腫脹，形成空泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核邊界形狀不規(guī)則，出現(xiàn)核固縮破裂溶解，神經(jīng)細(xì)胞大量損傷，數(shù)量較少(P<0.05)。同SAH組比較，Edaravone組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較SAH組明顯增多(P<0.05)，形態(tài)有所恢復(fù)，接近正常；U0126組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，細(xì)胞損傷加重，細(xì)胞數(shù)量較SAH組明顯減少(P<0.05)。HE染色結(jié)果見圖1，細(xì)胞計(jì)數(shù)分析見表1。

Sham組

SAH組

Edaravone組

U0126組

圖1 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞HE染色(HE×400)

注：與Sham組比較，*P<0.05； 與SAH組比較，△P<0.05。

2.2各組大鼠海馬區(qū)beclin-1、LC3-Ⅱ、p-ERK1/2的表達(dá)beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)，陽性細(xì)胞胞質(zhì)中可見大量棕黃色顆粒。與Sham組比較，SAH組陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P=0.000)；與SAH組比較，Edaravone組陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多(P=0.000)、U0126組陽性細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P=0.000)。

陽性p-ERK1/2主要定位于細(xì)胞核，少數(shù)表達(dá)在細(xì)胞漿,陽性細(xì)胞染色呈棕黃色。Sham組大鼠陽性細(xì)胞數(shù)目較少，與Sham組比較，SAH組p-ERK1/2蛋白陽性細(xì)胞數(shù)量較多(P=0.000)。與SAH組比較，Edaravone組p-ERK1/2蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)量明顯增加(P=0.000)、U0126組p-ERK1/2蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)量明顯減少(P=0.000),見圖2、表2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Edaravone治療可使SAH大鼠存活神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，提示其具體有神經(jīng)保護(hù)作用。劉宏雅[10]在腦出血患者應(yīng)用Edaravone治療和常規(guī)治療的對照中，發(fā)現(xiàn)其可以延緩神經(jīng)細(xì)胞死亡和神經(jīng)功能障礙，改善腦功能，提高腦出血患者的生活質(zhì)量；彭秉綱等[11]和滕秀涵[12]應(yīng)用Edaravone對腦出血患者治療后發(fā)現(xiàn)其具有保護(hù)患者腦神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。本研究結(jié)果與眾多研究結(jié)果一致，但其具體的保護(hù)機(jī)制尚未闡明。自噬性死亡又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡(CDP)，是細(xì)胞的一種自我降解途徑，真核細(xì)胞在自噬相關(guān)基因調(diào)控下，通過自身溶酶體作用而降解細(xì)胞生物大分子、細(xì)胞器，以維持細(xì)胞的生長分化和穩(wěn)定的過程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬導(dǎo)致beclin-1和LC3-II蛋白表達(dá)異常增強(qiáng)，應(yīng)用Edaravone治療后其自噬蛋白表達(dá)量明顯增加。周波等[13]建立帕金森病(PD)小鼠腦細(xì)胞自噬模型，利用Edaravone對其進(jìn)行治療后發(fā)現(xiàn)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞beclin-1和LC3-II蛋白表達(dá)量相對于對照組明顯增加，且神經(jīng)細(xì)胞死亡率下降；徐繼偉等[4]在建立的SAH模型中應(yīng)用Edaravone治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LC3-II、beclin-1表達(dá)顯著增加，大鼠抓力恢復(fù)明顯，神經(jīng)損傷下降。本研究結(jié)果與此結(jié)果一致，說明Edaravone能夠上調(diào)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，適度激活自噬，保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞，減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

表2 各組大鼠海馬區(qū)Beclin-1、LC3-Ⅱ和p-ERK1/2蛋白表達(dá)

注：與Sham組比較，*P<0.05；與SAH組比較，△P<0.05。

圖2各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞beclin-1、LC3-Ⅱ、p-ERK1/2的表達(dá)

ERK1/2是MAPK家族中的一類，其信號通路是最經(jīng)典的MAPK信號通路，為三級激酶級聯(lián)反應(yīng)，即Ras-Raf-MEK-ERK1/2通路。當(dāng)Ras受到外界鳥苷酸交換因子(GEF)刺激時(shí)可與三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合成為激活肽，GTP-Ras可以磷酸化Raf進(jìn)而活化MEK/ERK[14]。而U0126是ERK1/2信號蛋白的特異性阻滯劑，可以有效地抑制ERK1/2磷酸化過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SAH組相比較，U0126組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量降低，ERK1/2信號通路明顯被抑制。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，Edaravone治療組p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，同時(shí)自噬水平也明顯被上調(diào)。說明ERK1/2通路與自噬的激活之間存在正反饋循環(huán)，ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活能降低神經(jīng)細(xì)胞自噬水平的表達(dá)。楊淑娟等[15]對TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞應(yīng)用碧蘿芷下調(diào)ERK1/2磷酸化水平后，自噬水平也明顯被抑制，細(xì)胞損傷加重；劉俊杰等[16]對SAH大鼠早期腦損傷應(yīng)用MEK的特異性阻滯劑U0126抑制ERK1/2信號通路后，大鼠自噬水平下降，腦損傷加重。綜上所述，認(rèn)為Edaravone可以通過ERK1/2信號蛋白的磷酸化適度提高神經(jīng)細(xì)胞自噬的表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

目前研究認(rèn)為SAH后的腦血管痙攣(CVS)并非發(fā)生遲發(fā)性腦缺血(DCI)和遲發(fā)性缺血性腦損傷(NIND)的先決條件，而SAH后的早期腦損傷(EBI)則被認(rèn)為是參與NIND發(fā)生的重要原因[2]，而自噬在SAH后EBI中起保護(hù)作用，可以緩解EBI中的病理生理進(jìn)程[17]，但是目前對SAH后自噬的研究僅涉及到復(fù)雜的病理過程中的一小部分。本實(shí)驗(yàn)通過研究發(fā)現(xiàn)Edaravone可以激活ERK1/2信號蛋白，適度地提高了自噬的水平，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，以期為改善SAH患者預(yù)后和探索自噬在SAH中的作用提供方法和思路。

[1] TOPKORU B C, ALTAY O, DURS K, et al. Nasal administration of recombinant osteopontin attenuates early brain injury after subarachnoid hemorrhage[J]. Stroke, 2013, 44(11): 3189-3194.

[2] 冷放達(dá),閆軍浩.蛛網(wǎng)膜下腔出血研究: 從腦血管痙攣到早期腦損傷[J].解剖科學(xué)進(jìn)展,2016,22(6):650-653.

[3] 藺素英.腦保護(hù)劑Edaravone在蛛網(wǎng)膜下腔出血中的臨床應(yīng)用[J]. 醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2013,12(24):3257-3259.

[4] 徐繼偉,趙雅寧,李建民,等. Edaravone對SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2016,4(4):531-535.

[5] 高陽.Edaravone治療大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究[D].南京醫(yī)科大學(xué),2008.

[6] 陳禹廷,劉俊杰,丁家杉,等. 抑制JNK通路對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬與學(xué)習(xí)記憶功能的影響[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2017,40(2):196-200，205.

[7] 丁煌,唐映紅,黃小平.自噬在腦缺血性損傷中的作用[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào),2015,7(8):1048-1052.

[8] 覃芳,張智博.JNK信號通路與自噬的研究進(jìn)展[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,40(9):1035-1038.

[9] KLEIN J, CRANER M, CUMMINS T R, et al. Sodium channel expression in hypothalamic osmosensitive neurons in experimental diabetes[J].Neuroreport,2002,13(11):1481-1484.

[10] 劉宏雅.Edaravone治療腦出血的療效觀察[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2008,11(2):119-120.

[11] 彭秉綱,蘇赤,肖彧,等.Edaravone對急性腦出血患者自由及含量的影響及臨床效果探討[J].臨床醫(yī)學(xué)工程,2016,2(35):633-634.

[12] 滕秀涵.Edaravone治療腦出血患者的臨床療效[J].中國藥物經(jīng)濟(jì)學(xué),2016,11(4):62-63.

[13] 周波,文敏,王赟,等.Edaravone對帕金森病小鼠模型中腦細(xì)胞自噬的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012,50(8):1-4.

[14] MEBRATU Y, TESFAIGZI Y. How ERK1/21/2 actication controls cell proliferation andcell death:Is subcellular localization the answer[J]Cell Cycle,2009,8(8):1168-1175.

[15] 楊淑娟,何英利,馬曉華,等. 碧蘿芷通過下調(diào)ERK1/2磷酸化及自噬水平抑制TGF-自噬誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化[J]. 中國病理生理雜志,2016,12(12):2261-2265.

[16] 劉俊杰,趙雅寧,陳禹廷,等.ERK1/2信號通路抑制劑U0126對SAH大鼠早期腦損傷及神經(jīng)元自噬的影響[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2017,38(1):1-7.

[17] 肖遙,徐善才,史懷璋,等.自噬在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中作用的研究進(jìn)展[J].中國腦血管病雜志,2016,10(10):553-556.