PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白抑制宿主先天性免疫的分子機(jī)制

徐善之 田質(zhì)高 陳 飛

（張家港出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇張家港 215600）

豬繁殖和呼吸障礙綜合征，俗稱“藍(lán)耳病”，是由豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）引起的一種急性烈性傳染病，其于1987年在美國(guó)中西部地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。1996年我國(guó)學(xué)者第一次從國(guó)內(nèi)PRRSV血清陽(yáng)性豬群中分離到該病毒[1]，隨后該病毒傳播至全國(guó)各地并于2006年出現(xiàn)高致病性毒株[2,3]。PRRSV屬于套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬的單股正鏈RNA病毒，約15.4 kb，包含至少10個(gè)開(kāi)放閱讀框，通過(guò)2個(gè)移碼位點(diǎn)至少編碼16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[4]。豬是PRRSV的唯一宿主，PRRSV感染后主要侵害豬肺臟的肺泡巨噬細(xì)胞。

先天免疫是機(jī)體防御病原微生物感染的第一道防線，其在病毒早期的感染過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。干擾素是先天免疫的重要組成部分，具有抗病毒、影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能?，F(xiàn)在通用的分類方法將干擾素分為三種類型：Ⅰ型主要包括IFN-α 和 IFN-β，其中 IFN-α 具有多種亞型，IFN-β僅有一個(gè)亞型；Ⅱ型只有 IFN-γ；Ⅲ型即IFN-λ1（IL-29）、IFN-λ2（IL-28a） 和 IFN-λ3（IL-28b），最近又剛發(fā)現(xiàn)了IFN-λ4[5,6]。其中，Ⅰ型干擾素在抗病毒感染過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，然而PRRSV編碼了多種非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp1、Nsp2、Nsp4、Nsp11）抑制了Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生并采取了多種策略干擾了其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而引起了宿主明顯的免疫抑制現(xiàn)象。

1 PRRSV-Nsp1拮抗Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的先天免疫的機(jī)制

PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白 1（Nsp1） 自身剪切為Nsp1α和Nsp1β兩個(gè)蛋白，這兩個(gè)蛋白都具有很強(qiáng)的抑制干擾素的能力。IRF3是先天免疫反應(yīng)信號(hào)通路中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其被磷酸化后入核，隨即刺激IFN-β的產(chǎn)生。Kim等[7]研究表明，Nsp1α可以通過(guò)降解細(xì)胞核內(nèi)的CBP來(lái)抑制IFN-β的產(chǎn)生，盡管Nsp1α不能抑制IRF3的磷酸化和核轉(zhuǎn)移，但Nsp1α引起的CBP的降解減少了CBP與IRF3的結(jié)合，從而不能在核內(nèi)形成轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)復(fù)合體，最終導(dǎo)致IFN-β的產(chǎn)生受阻。Song等[8]進(jìn)一步研究表明Nsp1α蛋白C末端的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域是抑制干擾素的轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵區(qū)域，尤其是C末端的14個(gè)氨基酸，Shi等[9]通過(guò)突變C末端的一系列氨基酸表明F176為抑制IFN的關(guān)鍵氨基酸。

Beura等[10]研究表明，Nsp1β可以通過(guò)抑制IRF3的磷酸化以及JAK/STAT信號(hào)通路來(lái)影響宿主的先天性免疫反應(yīng)。Nsp1β可以誘導(dǎo)KPNA1蛋白的降解，進(jìn)而影響了STAT1的入核，抑制了干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)，進(jìn)一步研究表明Nsp1β的第19位氨基酸是誘導(dǎo)KPAN1的泛素化降解和抑制干擾素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵氨基酸。此外，Song等[8]發(fā)現(xiàn)Nsp1α 和Nsp1β能夠抑制IκB的磷酸化，從而抑制IκBα的降解，影響了NF-κB的釋放和入核，進(jìn)而影響了干擾素的產(chǎn)生。

2 PRRSV-Nsp2拮抗Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的先天免疫的機(jī)制

PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白2（Nsp2）是其基因組編碼的分子量最大、也是最易變異的蛋白，其參與病毒感染過(guò)程中的多個(gè)環(huán)節(jié)并發(fā)揮重要功能。Nsp2主要由N端的半胱氨酸蛋白酶區(qū)域、中間的高變區(qū)、C端的跨膜區(qū)以及高度保守的富含半胱氨酸殘基的功能未知區(qū)域四個(gè)區(qū)域組成。其中Nsp2 N端的半胱氨酸蛋白酶具有切割活性，另外其也屬于卵巢腫瘤蛋白酶超家族，具有去泛素化酶（DUB）的活性，Nsp2的DUB可以抑制IRF3和NF-κB的先天性免疫信號(hào)通路的激活，從而抑制干擾素的產(chǎn)生，另外還可以抑制干擾素刺激基因ISG15的表達(dá)及其他抗病毒蛋白的ISG化來(lái)抵抗宿主細(xì)胞的抗病毒作用。

IRF3是先天免疫反應(yīng)信號(hào)通路中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其被磷酸化后入核，隨即刺激IFN-β的產(chǎn)生。Nsp2的半胱氨酸蛋白酶區(qū)可明顯抑制IRF3的磷酸化及其進(jìn)一步的入核，進(jìn)而抑制了IFN-β的產(chǎn)生。同IRF3一樣，NF-κB也是先天免疫反應(yīng)信號(hào)通路中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在正常情況下，其與IκB家族成員的分子結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)中。在受到刺激時(shí)候，將會(huì)激活I(lǐng)κB激酶而使IκB分子磷酸化繼而通過(guò)泛素蛋白酶體途徑被降解，此時(shí)NF-κB被釋放入核，刺激下游干擾素及其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Nsp2半胱氨酸蛋白酶功能域通過(guò)其去泛素化功能抑制了IκBα多聚泛素體的降解，影響了NF-κB的釋放和入核，進(jìn)而影響了干擾素的產(chǎn)生。ISG15是一個(gè)由I型干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的泛素化樣蛋白，在細(xì)胞中以自由分子或與其他蛋白偶聯(lián)的形式存在，在天然免疫中發(fā)揮著重要作用，Nsp2抑制了干擾素的產(chǎn)生從而下調(diào)了ISG15的表達(dá)，另外Nsp2通過(guò)其半胱氨酸蛋白酶功能域的去泛素化功能抑制了其他抗病毒蛋白的ISG化，從而抵抗了宿主細(xì)胞的抗病毒作用。

3 PRRSV-Nsp4拮抗Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的先天免疫的機(jī)制

PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白4（Nsp4）具有3C樣絲氨酸蛋白酶活性，在病毒增殖過(guò)程中對(duì)病毒蛋白表達(dá)及加工起核心作用，能夠水解多聚蛋白pp1a/pp1ab，產(chǎn)生Nsp3至Nsp12共10種成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白。關(guān)于PRRSV-Nsp4抑制I型干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制，文獻(xiàn)報(bào)道主要是通過(guò)Nsp4本身的蛋白酶活性切割接頭分子MAVS和NEMO，阻礙了IRF3和NF-κB的活化進(jìn)而抑制了IFN-β的激活。另外，陳智比較了高低致病性PRRSV毒株Nsp4對(duì)IFN-β的抑制能力，發(fā)現(xiàn)Nsp4的亞細(xì)胞定位也可能與IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)。

線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）是先天免疫信號(hào)通路中一個(gè)重要的接頭分子，它的活化將激活核轉(zhuǎn)錄因子必須調(diào)節(jié)基因NEMO以及TANK結(jié)合激酶1，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和IRFs，刺激IFN-β的產(chǎn)生。董劍鳴研究表明，PRRSV-Nsp4底物的酶切位點(diǎn)有一定的特異性，即通過(guò)識(shí)別底物Glu-Gly、Glu-Ala和Glu-Ser殘基位點(diǎn)特異性切割底物。其可通過(guò)識(shí)別MAVS的第268位氨基酸切割MAVS，切割后的兩個(gè)片段（1-268和269-540）都不能有效誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生。Huang等研究表明，Nsp4通過(guò)識(shí)別NEMO的第349位氨基酸切割NEMO，進(jìn)而影響了其下游通路，抑制了IFN-β的產(chǎn)生。另外，陳智發(fā)現(xiàn)高低致病性PRRSV毒株Nsp4存在兩個(gè)保守的氨基酸位點(diǎn)差異，其試驗(yàn)結(jié)果表明Nsp4的第155位氨基酸是影響Nsp4抑制IFN-β轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵位點(diǎn)。

4 PRRSV-Nsp11拮抗Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的先天免疫的機(jī)制

PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白11（Nsp11）具有核酸內(nèi)切酶活性，其含有一個(gè)具有內(nèi)切核糖核酸酶功能的NendoU區(qū)。關(guān)于PRRSV-Nsp11抑制I型干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制，文獻(xiàn)報(bào)道主要是Nsp11抑制了IRF3及IκBα的磷酸化，進(jìn)而影響了干擾素的產(chǎn)生。Shi等研究表明Nsp11第129位的氨基酸殘基參與了對(duì)IRF3磷酸化的抑制。Wang等研究發(fā)現(xiàn)Nsp11具有去泛素化的功能，其抑制了K-48位連接的IκBα多聚泛素體的降解，影響了NF-κB的釋放和入核，進(jìn)而影響了干擾素的產(chǎn)生。

5 討論

豬繁殖和呼吸障礙綜合征是影響我國(guó)乃至全球養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán)重的疾病之一，但是由于其快速變異、持續(xù)感染、免疫抑制、誘導(dǎo)中和抗體水平低下、抗體依賴性增強(qiáng)作用（ADE）以及易引起繼發(fā)感染等眾多問(wèn)題的存在，至今未找到一種有效安全的方式對(duì)其進(jìn)行防控。俗話說(shuō)“知彼知己，百戰(zhàn)不殆”，只有清楚PRRSV的致病機(jī)理，才能針對(duì)性地探索其防控方法。本文綜述了PRRSV利用其四種非結(jié)構(gòu)蛋白逃逸宿主先天免疫的機(jī)制，就PRRSV致病、造成免疫抑制的原理做了總結(jié)，希望能為PRRSV的防控及新型疫苗及藥物的研發(fā)提供新的路徑。

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（部分參考文獻(xiàn)略）