環(huán)磷酰胺聯(lián)合白頭翁多糖體內抗乳腺癌作用初探

劉娟 杜凌艷（通訊作者）

（樂山市人民醫(yī)院 四川 樂山 614000）

乳腺癌作為一種全球女性發(fā)病率最高的惡性疾病，除早期患者選擇單一的手術或放射治療可達到治愈目的外，目前乳腺癌已進入綜合治療時代，中、晚期患者均采取手術、化療及放療結合治療。環(huán)磷酰胺作為常用烷化類抗腫瘤化療藥物，在治療惡性腫瘤、免疫性相關及器官移植等疾病中發(fā)揮重要作用。近幾年，一些研究者發(fā)現(xiàn)高等植物提取的多糖具有抗腫瘤活性，且抗腫瘤活性與其增強免疫功能有關[1]。又因中醫(yī)藥安全、有效、副作用小的特點，研究者們開始將中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥作為新的抗腫瘤藥物進行研究，天然植物防治乳腺癌的臨床與實驗研究正逐步引起世人的關注[2-3]。

白頭翁（Radix Pulsatillae）清熱解毒、涼血止痢，現(xiàn)代醫(yī)學證實[4]其具有抗炎、抗菌、抗腫瘤及調節(jié)免疫的作用。目前對白頭翁的抗腫瘤藥理作用研究成為焦點[5]。

1.材料

動物：BALB/c小鼠，SPF級，雌性，體重18～20g，購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心（SCXK-（軍）2016-004）。

細胞株：4T1乳腺癌細胞，購于中國醫(yī)科院腫瘤細胞庫。

試驗用藥：環(huán)磷酰胺（CTX），上海華聯(lián)制藥有限公司產品（批號：20160916）；白頭翁草藥由本院中藥房提供，符合國家藥典正品標準。

2.方法

2.1 白頭翁多糖的提取

多糖提取時由于真空濃縮，產品黏著于瓶子內壁，造成收率較低，利用無水乙醇進行改良提取[6]。

取粉碎好的白頭翁100g，浸泡1h，3次煎煮（100℃，6h/次）后過濾，常壓濃縮至2/3體積，2500r/min離心30min，收集上清。真空濃縮后再次離心，待濃縮液成為糖漿狀后轉移至離心管，以無水乙醇少量多次溶解掛壁糖漿，并收集在同一離心管，靜置30min離心，冷凍干燥至恒重，得白頭翁多糖RP。

2.2 4T1細胞培養(yǎng)和乳腺癌荷瘤小鼠模型的建立[7]

以RPMI-1640培養(yǎng)基（胎牛血清10%；青霉素、鏈霉素100μg/ml）培養(yǎng)4T1腫瘤細胞，每隔3至4天分瓶傳代，將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞用于體內腫瘤的接種。PBS重懸細胞，濃度為1x107/ml，100ul/只，接種于實驗動物右側脅肋處。

2.3 實驗分組及給藥

待腫瘤體積長至100mm3時隨機分為四組：空白對照組（Vehicle），CTX（25mg/kg）組，CTX+RPL（25+50mg/kg）和CTX+RPH（25+100mg/kg）組，每組10只。RP灌胃給藥，CTX腹腔注射，連續(xù)給藥12天，Vehicle組灌服等劑量蒸餾水。

2.4 觀察指標

每天稱量小鼠體重，每周三次游標卡尺測量腫瘤的長、短徑，體積計算公式為：體積=0.536×長徑×短徑2，繪制小鼠體重及腫瘤體積變化圖[8]。

實驗結束時剝離瘤體，稱重，計算抑瘤率[10]；解剖獲得脾臟、胸腺，對其進行重量分析，計算脾臟（胸腺）指數(shù)[9]。

2.5 統(tǒng)計學方法

應用統(tǒng)計學SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析[11]，單因素方差解析，以P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

3.結果

3.1 體重分析

給藥過程中，動物一般狀態(tài)良好，未表現(xiàn)明顯的體重降低。給藥6天至實驗結束，由于腫瘤體積的迅速增長，各治療組體重均顯著低于Vehicle組（P＜0.05），且CTX與CTX+RPH組間，體重差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 實驗動物體重變化曲線

3.2 腫瘤體積變化

給藥一周后，各治療組表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性（P＜0.01），但各組間無顯著性差異；實驗結束時，各治療組腫瘤體積顯著低于Vehicle組，且與CTX組相比，CTX+RPL、CTX+RPH組抗腫瘤作用差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），CTX+RPL、CTX+RPH組間抗腫瘤作用差異具有顯著性（P＜0.05），見圖2。

圖2 腫瘤生長曲線

3.3 瘤重及抑瘤率

與Vehicle組相比，各治療組腫瘤重量均顯著降低（P＜0.01），抑瘤率明顯提高（P＜0.05，P＜0.01）；此外，與CTX組比較，CTX+RPH組腫瘤重量顯著降低（P＜0.05），抑瘤率明顯升高（P＜0.05）；與CTX+RPL組相比，CTX+RPH組抑瘤率差異不明顯，整體趨勢與腫瘤體積基本一致，見表1。

表1 腫瘤重量及抑瘤率

3.4 脾臟及胸腺指數(shù)

與Vehicle組相比，CTX治療導致各組小鼠的脾臟及胸腺指數(shù)水平明顯降低，而RP參與治療可逆轉此趨勢，其中CTX+RPH組對脾臟指數(shù)的升高具有顯著性差異（P＜0.05）。RP對胸腺指數(shù)水平雖有一定程度的升高，但此升高作用無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 各組脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)

4.討論

此研究探討環(huán)磷酰胺聯(lián)合白頭翁多糖對4T1乳腺癌移植瘤模型的抗腫瘤活性，結果表明環(huán)磷酰胺對小鼠乳腺癌抑瘤作用明確，白頭翁多糖能夠提高環(huán)磷酰胺的抗腫瘤作用，而且在一定程度上提高了小鼠的免疫力。

當代社會乳腺癌嚴重危害著女性的身心健康，對其研究已經成為人類社會關注的焦點。環(huán)磷酰胺作為廣譜的抗癌藥物，能夠明顯抑制腫瘤生長，但其免疫抑制作用應引起重視，即殺傷腫瘤的同時對正常組織器官造成不同程度的損傷。本研究亦證明，環(huán)磷酰胺對荷瘤鼠的免疫器官（脾臟、胸腺）有較強的抑制作用，因此，尋找一種能夠實現(xiàn)增效減毒作用的輔助藥物具有重要意義。

研究報道[12-13]顯示，白頭翁多糖具有一定的抗腫瘤活性，并拮抗CTX導致的吞噬功能抑制。本研究顯示，單用CTX組荷瘤鼠脾臟和胸腺指數(shù)明顯下降，與白頭翁多糖聯(lián)合用藥后，增強抑瘤作用的同時，脾臟和胸腺得到了緩解，且在一定的濃度范圍內，白頭翁多糖給藥量越高，指數(shù)提高越顯著。

本研究對環(huán)磷酰胺聯(lián)合白頭翁多糖的體內抗乳腺癌作用進行了初步探對，驗證了環(huán)磷酰胺的抗乳腺癌作用，亦驗證了白頭翁多糖對環(huán)磷酰胺的增效減毒作用，為降低環(huán)磷酰胺的副作用提供可行的臨床治療方案，打破其因不良反應而被限制應用的僵局。同時對于弘揚祖國傳統(tǒng)醫(yī)學、中藥現(xiàn)代化具有重要意義，并對完善天然化合物抗乳腺癌研究提供一定的理論基礎。

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