MEGJ調(diào)節(jié)缺氧后血管平滑肌細(xì)胞低反應(yīng)性的cAMP-PKA機制

徐 競，楊光明，李 濤，劉良明

血管低反應(yīng)性是嚴(yán)重創(chuàng)傷/休克等臨床重癥晚期的重要病理生理改變，是導(dǎo)致患者對血管活性物質(zhì)的舒縮反應(yīng)功能降低甚至喪失，即使積極復(fù)蘇仍然無法維持血壓，甚至復(fù)蘇失敗和患者死亡的重要原因[1]。

本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)，失血性休克晚期表達(dá)增高的血管生成素-2 (angiopoietin-2，Ang-2)對血管誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和血管舒縮功能的調(diào)節(jié)是導(dǎo)致血管低反應(yīng)性發(fā)生的重要原因[2]。且實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)與血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)間的縫隙連接，即肌內(nèi)皮縫隙連接(myoendothelial gap junction，MEGJ)，介導(dǎo)了缺氧大鼠VSMCs的iNOS的表達(dá)增高和低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)，連接蛋白43(connexin43，Cx43)是參與其中的縫隙連接子亞型調(diào)節(jié)分子，但MEGJ和Cx43通過何種機制介導(dǎo)Ang-2對缺氧VSMCs中iNOS高表達(dá)和血管低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)，目前仍不清楚。

因此，本實驗采用大鼠VECs和VSMCs的雙面共培養(yǎng)模型，觀察抑制可能的CX43調(diào)節(jié)信號分子后VSMCs中iNOS表達(dá)和收縮反應(yīng)性的變化，篩選出參與調(diào)節(jié)的信號分子PKA；然后觀察抑制cAMP-PKA系統(tǒng)后，MEGJ中Cx43蛋白表達(dá)、MEGJ形成和通訊功能的變化，明確MEGJ和Cx43介導(dǎo)Ang2對缺氧VSMCs中iNOS高表達(dá)和血管低反應(yīng)性調(diào)節(jié)的機制。

材料與方法

1 實驗動物和試劑

清潔級SD大鼠(雌雄各半，體重200～230g)購買自第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實驗動物中心?？勾笫螃?actin，Cx43，iNOS抗體，外源性重組Ang2，F(xiàn)ITC-BSA，Sulforhodamine B，cAMP ELISA試劑盒，PKC抑制劑Stausoporine，PKA抑制劑H-89，PKG 抑制劑KT-5823，cAMP抑制劑Rp-8-Br-cAMP購自Sigma公司; 羊抗兔或抗小鼠IgG二抗購自Pierce公司。Tie2 siRNA購自Thermo Fisher Scientific公司。Src抑制劑SU6656 購自Merck公司。Influx Pinocytic細(xì)胞加載試劑購自Molecular Probes公司。FITC-標(biāo)記的phalloidin 購自Invitrogen公司。PKA 活性檢測試劑盒 購自Enzo Life Sciences。

2 VECs和VSMCs雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)建立，實驗分組和缺氧處理

共培養(yǎng)模型：按照文獻(xiàn)中的方法[3]建立VECs和VSMCs的雙面共培養(yǎng)模型：首先原代分離和培養(yǎng)SD大鼠的VECs和VSMCs，再采用Transwell雙面培養(yǎng)皿(Corning公司，膜孔徑為0.4μm)，先在膜反面接種VSMCs，接種密度1×105細(xì)胞/培養(yǎng)皿，CO2孵箱中培養(yǎng)1d后將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，然后在膜正面接種VECs，接種密度2×105細(xì)胞/培養(yǎng)皿，最后將雙面均接種好細(xì)胞的雙面培養(yǎng)皿置于CO2孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)3d達(dá)到細(xì)胞>90%融合，即可用于后續(xù)實驗。

實驗分組：取已接種VECs和VSMCs細(xì)胞并培養(yǎng)好的雙面培養(yǎng)皿，隨機分組，對照組無需任何藥物和缺氧處理；Ang2+缺氧組加入外源性重組Ang2(200ng/mL)后再行缺氧；PKA/PKC，PKG，Src抑制劑+Ang2+缺氧組分別加入H-89 (10μmol/L)，Stausoporine (0.1μmol/L)，KT-5823 (1μmol/L)，SU6656 (2μmol/L)，再加入外源性重組Ang2(200ng/mL)，然后再缺氧處理；Tie2 SiRNA+Ang2+缺氧組經(jīng)Tie2 siRNA(25nmol/L)轉(zhuǎn)染后，加入外源性重組Ang2(200ng/mL)，然后再缺氧處理；cAMP/PKA抑制劑+Ang2+缺氧組分別加入Rp-8-Br-cAMP (100μmol/L)和H-89 (10μmol/L)，再加入外源性重組Ang2(200ng/mL)，然后再缺氧處理。

缺氧處理：取已加入藥物處理好的雙面培養(yǎng)皿，置入缺氧罐，反復(fù)充入缺氧氣體(5%CO2和95%N2)和夾閉，充氣時間15min，夾閉時間10min，經(jīng)“充氣-夾閉”5個循環(huán)后，夾閉4h，完成缺氧處理。

3 VSMCs收縮反應(yīng)性測定

按照文獻(xiàn)[2]，取缺氧等處理完成的雙面培養(yǎng)皿，將每個樣本設(shè)兩個雙面培養(yǎng)皿，一個為實驗皿加去甲腎上腺素處理(Norepine-phrine,NE)，另一個為對照皿不加去甲腎上腺素處理。在雙面培養(yǎng)皿的上腔液中加入FITC-BSA(10mg/mL)，然后在下腔液中加入NE或培養(yǎng)基 (實驗皿中加入1×10-9mol/L的NE，對照皿中加入與NE等體積的培養(yǎng)基)。每間隔15min從下腔液中抽取等體積培養(yǎng)液，采用多功能酶標(biāo)儀讀出熒光值，計算累計熒光通透率，VSMCs的收縮反應(yīng)性=累計熒光通透率(實驗皿)-累計熒光通透率(對照皿)。

4 VSMCs、MEGJ蛋白提取和蛋白表達(dá)檢測

取按實驗分組完成缺氧等處理的雙面培養(yǎng)皿，在細(xì)胞裂解液中刮取雙面培養(yǎng)皿膜的下表面得到VSMCs的細(xì)胞成分，再將刮干凈的膜切下來，剪成小碎片，置于細(xì)胞裂解液中，旋轉(zhuǎn)震蕩后得到MEGJ成分。最后將分別含有VSMCs和MEGJ成分的細(xì)胞裂解液在完成裂解30min后，4°C 12000×g離心15min即分別得到VSMCs、MEGJ的蛋白成分。蛋白表達(dá)檢測采用常規(guī)Western blot方法，檢測VSMCs中iNOS蛋白表達(dá)時采用β-actin做內(nèi)參，檢測MEGJ中Cx43蛋白表達(dá)時采用GAPDH做內(nèi)參[4]。

5 MEGJ形成檢測

根據(jù)文獻(xiàn)采用phalloidin熒光觀察MEGJ形成[4]：取按實驗分組完成缺氧等處理的雙面培養(yǎng)皿，先用PBS洗細(xì)胞一次，再用多聚甲醛在37°C固定30min，然后切取雙面培養(yǎng)皿膜做冰凍切片(厚度10μm)，在0.25% Triton X-100 和1%BSA混合液中常規(guī)透膜并封閉30min，再用FITC-標(biāo)記的phalloidin在37°C孵育30min，熒光顯微鏡成像，經(jīng)膜孔的phalloidin顯示MEGJ，用單位面積的像素密度(/mm2)進(jìn)行定量。

6 MEGJ通訊功能檢測

根據(jù)文獻(xiàn)觀察染料Sulforhodamine B的轉(zhuǎn)運反應(yīng)MEGJ通訊功能[3]：取按實驗分組完成缺氧等處理的雙面培養(yǎng)皿，先用Influx Pinocytic細(xì)胞加載試劑在VECs中加載熒光染料Sulforhodamine B，濃度1mg/mL，穩(wěn)定10min后，切取分離培養(yǎng)皿膜，以Leica TCS-SP激光共聚焦顯微鏡沿Z軸進(jìn)行XY平面層掃，掃描間隔0.13μm。用VECs側(cè)和VSMCs側(cè)XY平面的Sulforhodamine B熒光密度差值定量MEGJ通訊功能。

7 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1 參與Ang2對VSMCs中iNOS表達(dá)和收縮反應(yīng)性調(diào)節(jié)的信號分子

在雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)，與正常對照組比較，缺氧后VSMCs中iNOS表達(dá)顯著增高(圖1a,P=0.006)，而收縮反應(yīng)性顯著降低(圖1b,P=0.005)，外源性Ang2可維持增高的iNOS表達(dá)和降低的收縮反應(yīng)性。在雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)上腔(VECs面)分別給予PKA、PKC、PKG、Src抑制劑(H-89，Stausoporine，KT-5823，SU6656)后，再觀察外源性Ang2+缺氧VSMCs中iNOS蛋白表達(dá)和VSMCs收縮功能的變化，發(fā)現(xiàn)與Ang2+缺氧組相比，PKA抑制劑H-89可顯著削弱其iNOS表達(dá)增高(圖1a)和收縮反應(yīng)降低(圖1b)(P值分別為0.008和0.005)，而其他抑制劑無顯著作用。

a b

圖1 參與Ang2對VSMCs中iNOS表達(dá)和收縮反應(yīng)性調(diào)節(jié)的信號分子。加在VECs面的PKA抑制劑可降低外源性Ang2作用下缺氧后VSMCs的iNOS蛋白高表達(dá)(A，n=3)，改善VSMCs低反應(yīng)性(B,n=4～5)。與正常對照相比:*P<0.05，與Ang2+缺氧組相比:#P<0.05

2 VECs中cAMP-PKA系統(tǒng)對MEGJ中Cx43蛋白表達(dá)、MEGJ形成和通訊功能的調(diào)節(jié)

與正常對照組比較，缺氧后VECs中cAMP濃度，以及PKA活性顯著增高(P<0.05)。與Ang2+缺氧組相比，Tie2 SiRNA可削弱cAMP濃度和PKA活性的增高(P<0.05)。見圖2。

圖2 缺氧及Ang2處理后VECs中cAMP濃度和PKA活性的變化。與正常對照相比：*P<0.05，與Ang2+缺氧組相比：#P<0.05

在雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)，與正常對照組比較，缺氧后MEGJ中Cx43蛋白表達(dá)(圖3a)、MEGJ形成(圖3b)和通訊功能(圖3c)均顯著增高(P值分別為0.006、0.005和0.001)。在雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)的VECs面給予cAMP或PKA抑制劑，發(fā)現(xiàn)與Ang2+缺氧組相比，增高的MEGJ中Cx43蛋白表達(dá)(圖3a)、MEGJ形成(圖3b)和通訊功能(圖3c)均可被顯著抑制(P值分別為0.004和0.005、0.007和0.007、0.01和0.01)。

圖3 VECs中cAMP-PKA系統(tǒng)對Cx43蛋白表達(dá)、MEGJ形成和通訊功能的調(diào)節(jié)。a.MEGJ中Cx43表達(dá);b.MEGJ形成，C: MEGJ通訊功能。anta: 抑制劑。b.中標(biāo)尺10μm;c.中標(biāo)尺 250μm。與正常對照相比：*P<0.05，與Ang2+缺氧組相比：#P<0.05

討 論

本實驗室前期研究表明，MEGJ介導(dǎo)了缺氧大鼠VSMCs的iNOS表達(dá)增高和低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)，Cx43是參與其中的縫隙連接蛋白亞型。而失血性休克晚期，增高表達(dá)的Ang-2作用于VEC中的Tie2受體后，經(jīng)何種初級信號級聯(lián)調(diào)節(jié)MEGJ的相關(guān)Cx亞型目前尚無文獻(xiàn)報道。

根據(jù)以往研究，多種蛋白激酶分子通過調(diào)節(jié)Cx蛋白的表達(dá)和磷酸化水平改變其通訊功能，例如PKA、PKC、PKG、Src[5-6]。因此筆者采用了這些激酶的抑制劑，觀察對外源性Ang2+缺氧大鼠VSMCs的iNOS表達(dá)和收縮反應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PKA抑制劑可以降低其VSMCs的iNOS高表達(dá)和VSMC低反應(yīng)性，而且缺氧后，VECs中cAMP濃度和PKA活性顯著增高，外源性Ang2可維持其增高，而Tie2 SiRNA可削弱其增高。在雙面共培養(yǎng)系統(tǒng)的VECs面給予cAMP或PKA抑制劑，均可顯著抑制Ang2+缺氧組的MEGJ中Cx43表達(dá)增高、MEGJ形成增多和通訊功能增強。提示缺氧后上調(diào)的Ang2可能通過cAMP-PKA系統(tǒng)增高M(jìn)EGJ的Cx43蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)MEGJ形成和通訊功能。以往文獻(xiàn)也報道，在大鼠提睪肌動脈，PKA可促進(jìn)VSMCs和VECs間的通道物質(zhì)轉(zhuǎn)運[7]，可促進(jìn)Cx43轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜和促進(jìn)GJ聚集[8]，cAMP水平增高可以增強Cx43組成通道對染料的通透[9]，這些均與筆者的實驗結(jié)果一致。

因此筆者研究發(fā)現(xiàn)，在失血性休克晚期，Ang-2經(jīng)Tie2受體在VEC中誘導(dǎo)cAMP-PKA系統(tǒng)的表達(dá)上調(diào)，通過增強MEGJ的Cx43表達(dá)，開放通道促進(jìn)細(xì)胞間通訊，從而調(diào)節(jié)VSMC中的iNOS表達(dá)和血管舒縮功能，導(dǎo)致血管低反應(yīng)性。

[1] Levy B，Collin S，Sennoun N，et al.Vascular hyporesponsiveness to vasopressors in septic shock：from bench to bedside[J].Intensive Care Med,2010,36(12)：2019-2029.

[2] Xu J，Lan D，Li T，et al.Angiopoietins regulate vascular reactivity after hemorrhagic shock in rats through the Tie2-Nitric oxide pathway[J].Cardiovasc Res，2012,96(2)：308-319.

[3] Isakson BE，Duling BR.Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization[J].Circ Res，2005,97(1)：44-51.

[4] Heberlein K，Straub AC，Best AK，et al.Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation [J].Circ Res，2010,106(6)：1092-1102.

[5] Maeda S，Tsukihara T.Structure of the gap junction channel and its implications for its biological functions[J].Cell Mol Life Sci，2011,68(7):1115-1129.

[6] Johnstone S，Isakson B，Locke D.Biological and biophysical properties of vascular connexin channels [J].Int Rev Cell Mol Biol,2009，278：69-118.

[7] Márquez-Rosado L，Solan JL，Dunn CA，et al.Connexin43 phosphorylation in brain，cardiac，endothelial and epithelial tissues [J].Biochim Biophys Acta,2012,1818(8)：1985-1992.

[8] Solan JL，Lampe PD.Connexin 43 phosphorylation-structural changes and biological effects [J].Biochem J，2009,419(2)：261-272.

[9] Wit C，Griffith TM.Connexins and gap junctions in the EDHF phenomenon and conducted vasomotor responses[J].Pflugers Arch，2010，459(6)：897-914.