禽源沙門氏菌對四環(huán)素耐藥分析

張博

（遼寧省撫順市動物疫病預(yù)防控制中心113006）

細菌耐藥性越來越成為公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點，四環(huán)素作為家禽養(yǎng)殖業(yè)的常用抗生素，其抗菌譜廣泛，對革蘭氏陽性及陰性菌均有抑制作用，但由于四環(huán)素的不合理使用，使得沙門氏菌等致病菌的耐藥性逐漸增強。耐藥基因作為一種新型的污染物質(zhì)，與耐藥菌的傳播有直接關(guān)系，本文以禽源性沙門氏菌為研究對象，采用藥敏試驗和耐藥基因檢測方法，分析了禽源性沙門氏菌對四環(huán)素的耐藥情況，為家禽養(yǎng)殖業(yè)合理使用四環(huán)素類抗生素提供指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 樣品分離培養(yǎng)

從遼東地區(qū)選擇3個育成雞場，采集健康雞群非重復(fù)肛試子樣品，用生理鹽水稀釋并接種在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再通過麥康凱培養(yǎng)基分離出沙門氏菌。

1.2 藥敏試驗

按照CLSI標準進行操作[1]，對分離株采用微量稀釋法測定沙門菌對四環(huán)素的MIC值。沙門菌對四環(huán)素的耐藥和敏感折點分別為MIC≥16μg/ml和MIC≤4μg/ml， 測定濃度范圍為 0.5～16μg/ml，質(zhì)控菌株為大腸桿菌 ATCC 25922。

1.3 耐藥基因檢測

根據(jù)GenBank已發(fā)表耐藥基因序列，對分離株進行4種四環(huán)素耐藥基因： tet（A）、 tet（B）、 tet（C）、 tet（D）檢測。根據(jù)Ng等[2]研究得到擴增目的基因引物序列及目的片段長度，引物由上海生工合成。PCR體系取模板 cDNA 2.0 μl， 10pmol/μl 上 下 游 引物各 1μl， 混合 Tag酶 9.5μl， 加入滅菌雙蒸水至25μl。PCR反應(yīng)條件為，95℃預(yù)變性 5min，94℃變性 30 s， 60℃30 s，72℃30 min，35個循環(huán)，72℃延伸10min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，于3.0%瓊脂糖凝膠中電泳，以檢測擴增效果。

2 試驗結(jié)果

2.1 藥敏試驗結(jié)果

本研究共分離鑒定沙門氏菌34株，通過對耐藥性檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，有30株沙門氏菌對四環(huán)素產(chǎn)生耐藥性，耐藥率為78.9%。

2.2 耐藥基因檢測結(jié)果

通過PCR定性檢測發(fā)現(xiàn)30株四環(huán)素耐藥菌中， 對 tet（A）、 tet（C）、 tet（B）均有檢出，tet（D）沒有檢出。其中檢出tet（A）的21株，檢出tet（C）的15株，檢出tet（B）的1株，檢出率分別為70%、50%和3.3%。tet（A）的檢出率最高，tet（D）的檢出率最低。 其中有 21株對 tet（A）、 tet（C）、tet（B）3種基因全部檢出。

3 討論

沙門氏菌是典型的禽類致病菌，四環(huán)素作為廣譜抗菌藥大量地應(yīng)用在沙門氏菌等細菌病的治療與預(yù)防上，由于其不合理的使用，導(dǎo)致沙門氏菌的耐藥性。本研究通過遼寧省東部從3個育成雞場分離鑒定出沙門氏菌34株，經(jīng)過藥敏試驗得出其中30株對四環(huán)素產(chǎn)生耐藥反應(yīng)，這說明在臨床上治療禽沙門氏菌病時，應(yīng)適當(dāng)減少或取代對四環(huán)素的使用。通過基因檢測試驗可以看出大部分對四環(huán)素耐藥的沙門氏菌都帶有四環(huán)素耐藥基因，其中tet（A）的檢出率最高，這是因為tet（A）基因主要位于結(jié)合性質(zhì)?；蛘咿D(zhuǎn)座子上，在對四環(huán)素耐藥的沙門菌中廣泛分布，耐藥基因的高檢出率對細菌耐藥性的傳播有直接關(guān)系，因此，耐藥基因 tet（A）、 tet（C）、 tet（B）的傳播是造成沙門氏菌對四環(huán)素抗生素耐藥的主要原因。

[1]Clinical and Laboratory Standards Institute.M100-S18 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing [M].Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2008.

[2]Ng LK,Martin I,Alfa M,et al.Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistant genes [J].Molecularand CellularProbes,2001,15（4）:209-215.