黑麥1RS染色體臂Sec-1位點的研究進(jìn)展

李亞青，張 楠，張士昌，何明琦，李孟軍

（石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北省小麥工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050041）

栽培黑麥（Secale cerealeL.）分蘗力強，小穗數(shù)多，抗多種病蟲害，根系發(fā)達(dá)，具有抗旱、耐鹽堿、耐貧瘠、耐寒、抗干熱風(fēng)等特性，是小麥育種中改善重要性狀和豐富遺傳多樣性的優(yōu)良基因供體[1，2]。小麥-黑麥1BL/1RS易位系是黑麥染色體存在于普通小麥染色體組的最常見的形式[3]。1BL/1RS易位系具有黑麥1RS攜帶的抗葉銹、稈銹、條銹和白粉病等抗病基因[4，5]，同時具有很好的豐產(chǎn)性和適應(yīng)性[1，6，7]。在世界小麥育種中，1BL/1RS易位系作為優(yōu)異基因資源被廣泛利用[8，9]，是外源基因用于小麥品種改良最成功的范例[10]，也是世界小麥育種史上繼矮稈基因之后的第2個革命性的工作。黑麥1RS染色體臂在提高小麥抗逆性、豐產(chǎn)性和穩(wěn)產(chǎn)性的同時，也給小麥的烘烤加工品質(zhì)帶來了顯著的負(fù)面效應(yīng)。1RSSec-1位點的引入和Glu-3/Gli-1位點的缺失是造成1BL/1RS易位系小麥加工品質(zhì)低下的主要原因[9，11，12]。對黑麥1RS染色體臂Sec-1位點在染色體上的定位，Sec-1位點編碼的40K γ-黑麥堿和ω-黑麥堿基因家族的特征，ω-黑麥堿對小麥品質(zhì)的影響，以及消除ω-黑麥堿不良影響的技術(shù)途徑進(jìn)行了闡述，旨為1BL/RS易位系的改良利用提供參考。

1 Sec-1位點在染色體上的定位

黑麥堿（secalin）是黑麥種子中的醇溶性儲藏蛋白，根據(jù)在SDS-PAGE上的電泳遷移率分為高分子量（HMW） 黑麥堿 （high molecular weight，≥100 kDa）、75K γ-黑麥堿 （75K γ-secalin）、ω-黑麥堿（ω-secalin，48～55 kDa） 和 40K γ-黑麥堿[13]。編碼HMW黑麥堿的基因位點（Sec-3） 位于1R染色體長臂上（1RL），而編碼ω-黑麥堿和40K γ-黑麥堿的基因位點（Sec-1） 位于1R染色體短臂上 （1RS），編碼75K γ-黑麥堿的基因位點（Sec-2）位于2R染色體上[14]。

編碼黑麥堿的基因位點在染色體上的定位是黑麥堿研究工作的熱點之一。在不同研究工作中，由于研究群體和方法的不同，這些編碼黑麥堿的基因位點的遺傳距離或重組率有所不同。Shewry等[14]通過分析2個黑麥自交系（Secale dighoricum和S.turkestanieum）組合的子代種子中的黑麥堿，發(fā)現(xiàn)Sec-3和Sec-1b（編碼ω-黑麥堿） 的重組率為40.8%±3.76%，遺傳距離為 （57.4±11.30） cM。Lawrence 等[15]分析了 2個組合（Rye26/Rye2a和Rye2a/R14） 子代種子中的黑麥堿，發(fā)現(xiàn)Sec-3和Sec-1的遺傳距離為（45.44±9.6） cM。Sybenga等[16]通過分析5個染色體重排的黑麥和黑麥自交株系的129個子代黑麥堿，發(fā)現(xiàn)Sec-1位于1RS的隨體上，距離端部C-帶的近端至少2.5 cM，距離核仁組織區(qū)大約30 cM。Benito等[17]分析了黑麥回交子代的染色體組成、儲藏蛋白和同工酶譜，發(fā)現(xiàn)Sec-3和 Sec-1b的遺傳距離為 （24.03±2.54） cM；Sec-1a（編碼40K γ-黑麥堿） 和Sec-1b緊密連鎖，遺傳距離為（0.33±0.33） cM。Carrillo等[18]分析了3個黑麥測交群體的黑麥堿，發(fā)現(xiàn)Sec-1b和Sec-1a緊密連鎖，重組率為0.25%±0.25%；對1個測交群體子代的黑麥堿分析發(fā)現(xiàn)，Sec-1和Sec-3重組率為36.03%±4.12%。Carrillo等[19]在2個黑麥測交群體中發(fā)現(xiàn)了新的ω-黑麥堿，編碼新ω-黑麥堿的位點與小麥的Gli-A3和Gli-B3位點同源，定名為Gli-R3（Sec-4）；Glu-R1（Sec-3） 和 Gli-R3的重組率為 33.80%±3.22%，Gli-R3和 Gli-R1（Sec-1） 的重組率為12.04%±2.21%。Orellana等[20]分析了2個黑麥自交系（8t和6Ri）的子代種子中的黑麥堿，發(fā)現(xiàn)Sec-3和Sec-1的重組率為44.12%±3.48%；Sec-1與著絲粒的重組率為36.27%±3.37%；Sec-1與端粒緊密連鎖，重組率為9.8%±2.08%。以基因組DNA pSec2B為探針的熒光原位雜交結(jié)果表明，黑麥的Sec-1定位在1R染色體短臂的隨體上，Sec-1位于隨體中部的常染色質(zhì)區(qū)的近端和異染色質(zhì)區(qū)的遠(yuǎn)端結(jié)合部位；以rDNA和pSec2B為探針的熒光原位雜交結(jié)果顯示，核仁組織區(qū)（nucleolar organizing region，NOR） 跨越1RS的次縊痕，在NOR和Sec-1之間有一個可見的間隙[21]。雖然關(guān)于Sec-1位點在染色體上定位有一定差異，但這些研究結(jié)果均表明，Sec-1位點遠(yuǎn)離著絲粒，位于1RS遠(yuǎn)端；Sec-1a和Sec-1b緊密連鎖。

2 40K γ-黑麥堿和 75K γ-黑麥堿

40K γ-黑麥堿由 1RS 上 Sec-1b 編碼，而 75K γ-黑麥堿由 1RL上 Sec-3編碼。40K γ-黑麥堿與75K γ-黑麥堿具有同源的N端氨基酸序列，二者的區(qū)別主要體現(xiàn)在分子量、氨基酸組成和聚集特性3個方面。在小麥和大麥基因組中未發(fā)現(xiàn)75K γ-黑麥堿的同源序列，因此，75K γ-黑麥堿基因被認(rèn)為是一種衍生基因。與40K γ-黑麥堿相比，75K γ-黑麥堿具有高比例的谷氨酰胺/谷氨酸酯和脯氨酸含量。這暗示，75K γ-黑麥堿基因可能來源于插入了富含谷氨酰胺和脯氨酸的 40K γ-黑麥堿基因[14]。Qi等[22]首次克隆了40K γ-黑麥堿基因全長序列，并對結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析。在聚類分析圖上，40K γ-黑麥堿與75K γ-黑麥堿明顯分為2組，這表明二者的初級結(jié)構(gòu)顯著不同。40K γ-黑麥堿與75K γ-黑麥堿的差別為：（1） 富含谷氨酰胺區(qū)域poly-Q的不同；（2） 重復(fù)單元的修飾；（3）N-端結(jié)構(gòu)域缺失1個半胱氨酸。

3 ω-黑麥堿基因家族

Hull等[23]利用Southern blotting分析小麥/黑麥附加系估計其基因組中ω-黑麥堿基因拷貝為40～60個。Clarke等[24]利用Southern blotting分析DRA-1（來源于小麥cv.Gabo，攜帶來自黑麥cv.Imperial的小片段），估計DRA-1基因組中ω-黑麥堿基因拷貝為10～20個，其中大約15個基因家族成員之間為8 kb的間隔序列，這些成員間隔序列在Sec-1位點上以頭尾相連方式排列，DNA序列全長約140 kb。Yamamoto等[25]利用 Fiber-FISH技術(shù)證明，在 Sec-1位點的145 kb區(qū)段上，ω-黑麥堿基因有15個拷貝，間隔序列8 kb，這些拷貝間隔序列以頭尾相連方式排列，與前人研究結(jié)果[26，27]一致。PCR產(chǎn)物克隆測序結(jié)果表明，ω-黑麥堿基因家族包括假基因和具有轉(zhuǎn)錄活性的成員。截至目前，已有多個ω-黑麥堿基因從黑麥或1BL/1RS易位系小麥中克隆出來，包括來自黑麥cv.Gazelle的 3個 （GenBank No.X60294、X60295和AF000227）[24，28]、DRA-1 的 9 個[29]、1BL/1RS 易位系cv.Lankao 906的5個[26]、黑麥cv.Rogo的16個[27]、六倍體小麥cv.AC Ultima的16個[27]、Octoploid triticale line H93-5305的15個[27]、1BL/1RS易位系 cv.Bob－white的15個[27]。Li等[30]首次通過對1BL/1RS易位系cv.Shimai 15 BAC克隆測序?qū)ec-1 ω-黑麥堿基因家族序列進(jìn)行了解析，在4個BAC克隆上發(fā)現(xiàn)了18個ω-黑麥堿基因家族成員，其中8個具有轉(zhuǎn)錄活性；基因家族成員之間的間隔序列長8.2～21.6 kb，這些成員間隔序列在BAC克隆上以頭尾相連方式排列。18個ω-黑麥堿基因家族成員可分為6種類型，間隔序列可分為2類。通過分析4個BAC克隆測序數(shù)據(jù)，并結(jié)合1BL/1RS易位系cv.aikang 58基因組測序數(shù)據(jù)，構(gòu)建了4個BAC克隆的跨疊群，跨疊群覆蓋Sec-1 258 kb。已有研究結(jié)果表明：（1）ω-黑麥堿基因家族至少具有18個成員；（2） 這些家族成員來自共同的祖先基因；（3） 家族成員之間的間隔序列長度不等；（4）家族成員/間隔序列以頭尾相連方式排列；（5）這些家族成員中僅少數(shù)成員具有轉(zhuǎn)錄活性；（6）ω-黑麥堿基因為無內(nèi)含子基因。

4 ω-黑麥堿對小麥品質(zhì)的影響

黑麥1RS染色體臂取替小麥1BS染色體臂提高了小麥的抗逆性、豐產(chǎn)性和穩(wěn)產(chǎn)性，但同時也降低了其烘烤加工品質(zhì)，主要表現(xiàn)為面團(tuán)粘性增加、面筋強度減弱、面團(tuán)形成時間顯著變短、最大拉伸阻力降低、面團(tuán)延伸性增加和面包體積減少等[9，10]。1BL/1RS易位系中，1BS上編碼低分子量麥谷蛋白亞基的位點Glu-3以及編碼γ-醇溶蛋白和ω-醇溶蛋白的位點Gli-1喪失，同時導(dǎo)入了1RS上編碼40K γ-黑麥堿和ω-黑麥堿的Sec-1位點。Sec-1位點編碼的40K γ-黑麥堿和ω-黑麥堿不能補償Glu-3和Gli-1編碼的低分子量麥谷蛋白以及γ-醇溶蛋白和ω-醇溶蛋白的品質(zhì)效應(yīng)，引起小麥麥谷蛋白聚合物結(jié)構(gòu)的改變和數(shù)量的減少，導(dǎo)致1BL/1RS易位系對SDS沉降值、和面時間、面團(tuán)延伸性、耐揉性和抗延阻力等加工品質(zhì)性狀產(chǎn)生顯著的負(fù)面影響[9，11，12]。Sec-1位點編碼的 40K γ-黑麥堿和ω-黑麥堿均為單體蛋白，其中ω-黑麥堿高度親水，幾乎不含半胱氨酸，無分子間和分子內(nèi)的二硫鍵的形成[24]。黑麥堿大量吸水后又很快溶解，使面團(tuán)的吸水性增大、持水性降低，致使面團(tuán)的穩(wěn)定性和延伸性降低，導(dǎo)致1BL/1RS小麥烘烤和蒸煮品質(zhì)下降[31]。因此，消除ω-黑麥堿對小麥品質(zhì)的不良影響是解決1BL/1RS易位系小麥面團(tuán)加工品質(zhì)差的重要途徑之一。

5 消除ω-黑麥堿對小麥品質(zhì)不良影響的途徑

5.1 引入Glu-3和Gli-1位點

重組染色體遺傳作圖表明，黑麥Sec-1與小麥的Gli-1/Glu-3不是同源等位基因位點[32]。因此，可以通過染色體工程技術(shù)對1RS染色體進(jìn)行遺傳改良。在1RS染色體臂上引入Gli-1/Glu-3，提高1BL/1RS易位系品質(zhì)的同時，保留其抗逆性、豐產(chǎn)性和穩(wěn)產(chǎn)性。Lukaszewski[33，34]利用攜帶具有誘導(dǎo)部分同源配對基因ph1b的Pavon小麥株系對1BL/1RS易位系進(jìn)行遺傳改良，獲得2種多點易位的改良的1RS（MA和Te），攜帶Gli-1/Glu-3，但缺失Sec-1位點。攜帶改良1RS的小麥，其配子活性降低，但在育種中的利用不受影響。

5.2 基因工程技術(shù)

任燕等[35]認(rèn)為反義RNA可降低黑麥堿表達(dá)量，但由于Sec-1位點很復(fù)雜，利用反義RNA去除由Sec-1位點產(chǎn)生的所有RNA來降低黑麥堿含量的方法可能難以實施。柴建芳等[36]構(gòu)建了ω-黑麥堿基因RNA干擾表達(dá)載體（RNAi載體），通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥品種金禾9123，成功獲得了純合的轉(zhuǎn)基因代株系。在轉(zhuǎn)基因株系中，ω-黑麥堿表達(dá)量平均下降53%，面筋指數(shù)、沉降值和穩(wěn)定時間顯著提高，而其株高、穗粒數(shù)和千粒重等農(nóng)藝性狀無明顯變化。該研究工作表明，通過遺傳工程降低或去除ω-黑麥堿基因表達(dá)量，從而提高1BL/1RS易位系小麥品質(zhì)的技術(shù)途徑具有可行性。

5.3 重離子束誘變技術(shù)

目前，通過會議交流和私人通訊獲知，國內(nèi)通過重離子束誘變獲得的ω-黑麥堿表達(dá)沉默突變體有2個——衡觀35和石麥15。其中，1BL/1RS易位系衡觀35的ω-黑麥堿表達(dá)沉默突變體由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所創(chuàng)制；石麥15的ω-黑麥堿表達(dá)沉默突變體由石家莊市農(nóng)林科學(xué)院小麥工程研究中心創(chuàng)制，其面團(tuán)形成時間和穩(wěn)定時間顯著提高，而農(nóng)藝性狀無明顯改變。目前，利用2個突變體開展的工作包括非1BL/RS易位系回交轉(zhuǎn)育和1BL/RS易位系中1RS染色體臂的替換。