魚皮膠原蛋白提取二肽基肽酶-IV抑制劑研究進(jìn)展

文/賴孟瑄 張金蘭 武瑞赟 李平蘭

膠原蛋白是多細(xì)胞生物中含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質(zhì)種類之一。傳統(tǒng)的天然膠原蛋白主要來自于哺乳動(dòng)物的皮膚和跟腱組織。但是，由于人畜共患疾病，哺乳動(dòng)物來源的膠原蛋白生物安全性受到消費(fèi)者的質(zhì)疑。近年來，水生膠原，尤其是魚類膠原日益受到研究者的重視。中國(guó)是世界漁業(yè)大國(guó)，不僅擁有廣闊的水域面積，而且魚類資源極為豐富，這為魚源膠原蛋白研究開發(fā)提供了充足的原料。目前，由于魚類加工和綜合利用技術(shù)不夠成熟，在魚類加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，如魚皮、魚骨、魚鱗、魚內(nèi)臟等，都尚待深入開發(fā)和研究利用。魚皮中富含膠原蛋白，為天然優(yōu)質(zhì)膠原蛋白的提取原料。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，通過提取魚皮中的膠原蛋白成分，可以制備如二肽基肽酶-IV（DPP-IV）抑制劑、抗氧化肽、血管緊張素抑制劑等功能性的產(chǎn)品。

一、 DPP-IV抑制劑的研究

目前，以胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）為靶點(diǎn)的II型糖尿病治療方案日益受到歡迎。GLP-1不僅可以維持人體內(nèi)血糖的平衡，還可以誘導(dǎo)前胰島素基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)胰島素的生物合成和分泌；刺激β細(xì)胞增殖和再生、抑制其凋亡，維持β細(xì)胞的數(shù)量和功能等多個(gè)途徑和機(jī)制共同參與血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV）是位于細(xì)胞表面的一種絲氨酸肽酶，其主要作用是優(yōu)先將氨基末端第2個(gè)氨基酸為丙氨酸（Ala）或脯氮酸（Pro）的寡肽的氨基末端的前兩個(gè)氨基酸剪切去除。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)天然GLP-1的氨基末端第2個(gè)氨基酸為丙氨酸，可被DPP-IV剪切，失去促胰島素分泌活性。DPP-IV使GLP-1失活的作用快速而不可逆，使得天然產(chǎn)生的活性GLP-1半壽期極短（<2 min）。因此DPP-IV抑制劑成為目前糖尿病治療藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。目前的DPP-IV活力臨床抑制劑主要包括西格列汀、維格列汀、沙格列汀、阿格列汀、利格列汀等。其中如西格列汀就是作為一種競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其通過與DPP-IV高保守的β-螺旋區(qū)域谷氨酸殘基Glu205和Glu206非共價(jià)結(jié)合抑制其活性。

化學(xué)合成的藥物，其副作用成為人們擔(dān)心的重點(diǎn)，食源性DPP-IV肽類抑制劑的開發(fā)為避免毒副作用開辟了新思路。目前對(duì)于食源活性肽的DPPIV抑制活性研究也在不斷豐富。張穎等人通過酶解提取出了牛、羊乳酪蛋白源DPP-IV抑制肽；王鳳等對(duì)燕麥多肽進(jìn)行了研究并對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行了提取分析，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)燕麥蛋白也是一類良好的DPP-IV活力抑制劑的肽源；吉薇等人利用動(dòng)物蛋白酶酶解南極磷蝦，不僅成功提取出了高抑制率的肽類產(chǎn)品，還進(jìn)一步對(duì)酶解條件等進(jìn)行了優(yōu)化并純化了分離出的短肽產(chǎn)品。因此，以食源蛋白質(zhì)為原料開發(fā)新的DPP-IV抑制劑成為近年來研究的重點(diǎn)。

二、魚皮與DPP-IV抑制活性的聯(lián)系

關(guān)于魚皮明膠的研究很多，其中含有豐富氨基酸的肽段，可以作為DPP-IV酶的作用靶點(diǎn)，從而作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑來開發(fā)應(yīng)用。目前已有很多研究以魚皮為原料提取的DPP-IV抑制劑。

Cheung I W Y等人利用不同的酶酶解虹鱒魚來提取膠原蛋白，并用提取的產(chǎn)物對(duì)DPP-IV活力抑制效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，列出了DPP-IV抑制活力較好的酶解條件和使用的酶種類。陳孟君等人以比目魚、吳郭魚、虱目魚魚皮明膠為原料，也分離出了有DPP-IV抑制活力的明膠產(chǎn)物。Wang等人通過實(shí)驗(yàn)，也測(cè)定了大比目魚皮水解產(chǎn)物和羅非魚皮膚明膠水解產(chǎn)物獲得的<1.5 kDa超濾級(jí)分，體外顯示的DPPIV抑制活性并且將它們用于體內(nèi)抗高血糖試驗(yàn)。結(jié)果表明富含亞氨酸的溫水魚皮明膠具有DPP-IV抑制活性，可用于改善前驅(qū)糖尿病的潛力。楊玲等人在對(duì)鱘魚魚皮明膠提取和功能性分析的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鱘魚皮中富含Pro、Ala、Hyp，而DPP-IV主要活性作用就是優(yōu)先將氨基末端第2個(gè)氨基酸為丙氨酸（Ala）或脯氮酸（Pro）的寡肽切除。由于鱘魚皮中存在這類豐富的氨基端，因此潛在的具有這種末端形式的肽段會(huì)十分豐富。所以，以鱘魚魚皮膠原蛋白為原料生產(chǎn)DPP-IV抑制劑，作為一類競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑發(fā)揮功效，有很高的潛力和研究?jī)r(jià)值，值得進(jìn)一步的深入研究。

三、酶解魚皮制備DPP-IV活力抑制劑的探究

在不同的魚皮酶解實(shí)驗(yàn)中，都使用了一種或多種酶進(jìn)行酶解。付余等人在對(duì)鮭魚皮進(jìn)行水解時(shí)主要選擇了堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶。在何娟等對(duì)鰱魚皮的水解實(shí)驗(yàn)中，除了以上這幾種酶以外，還選擇了風(fēng)味蛋白酶以及胰蛋白酶。莊永亮等在對(duì)羅非魚的酶解實(shí)驗(yàn)中除了分別利用堿性蛋白酶和中性蛋白酶以外，還添加了兩者復(fù)合水解的條件。程波等人在酶法提取鱘魚皮中膠原蛋白的實(shí)驗(yàn)里則是選擇了胃蛋白酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。上文提到的Cheung I W Y等人，在酶解虹鱒魚皮時(shí)使用了胃蛋白酶/Corolase N以及木瓜蛋白酶，其研究發(fā)現(xiàn)酶的不同選擇以及組合的方式的抑制效果有所不同，首先對(duì)單一酶的水解程度和抑制能力進(jìn)行評(píng)估，再篩選出合適的濃度以及酶解時(shí)間條件進(jìn)一步對(duì)酶的種類進(jìn)行組合，達(dá)到多種酶復(fù)合連續(xù)作用的效果，使產(chǎn)物的抑制率得到提高。

酶解條件的選擇，是探究酶解膠原蛋白的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中極為重要的組成部分。在酶解魚皮制備DPP-IV活力抑制劑的實(shí)驗(yàn)中，酶解的pH、酶解的溫度和時(shí)間以及酶的添加量都會(huì)對(duì)最終產(chǎn)品的抑制能力大小產(chǎn)生影響。以王小軍等人所做的有關(guān)鳀魚蛋白酶解條件響應(yīng)面優(yōu)化為例來看，一個(gè)完整的酶解過程應(yīng)該從設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)開始，探索不同酶解條件對(duì)水解程度以及產(chǎn)品DPP-IV活力抑制的能力，從而逐層優(yōu)化出有效果的酶解條件。在此條件下，進(jìn)一步通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)等構(gòu)建模型得到優(yōu)化后的酶解工藝條件。

四、功能性魚粉產(chǎn)品加工的探究

確定酶使用的種類以及酶解條件得到DPP-IV抑制肽，是開發(fā)魚皮活性肽產(chǎn)品的基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步生產(chǎn)和制作出食品級(jí)的、具有DPP-IV抑制活力的魚粉產(chǎn)品，還需要對(duì)進(jìn)一步探索產(chǎn)品的加工和復(fù)配。于東等人對(duì)膠原蛋白粉研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白粉加工方面主要涉及的流程包括膠原蛋白的提取、烘干制粉等關(guān)鍵步驟，過程中應(yīng)注意溫度的控制以及微生物的控制，防止出現(xiàn)污染和破壞。余宙等人在制備魚膠原蛋白粉的研究中，主要利用濃縮和噴霧干燥來生產(chǎn)，涉及到濃縮時(shí)的溫度和壓力、干燥時(shí)進(jìn)口和出口溫度的選擇。程波等人在提取鱘魚皮膠原蛋白，選擇先利用酶浸提出所需的膠原蛋白成分，再進(jìn)一步利用氯化鈉鹽析、進(jìn)一步透析干燥得到成品。值得注意的是，王國(guó)強(qiáng)等制取長(zhǎng)鰭金槍魚魚皮膠原蛋白肽的工藝探究中，還用到了到活性碳脫色。

除了以上討論的方面，值得進(jìn)一步優(yōu)化的魚粉生產(chǎn)加工方面還有很多。除了產(chǎn)品加工條件有待探究以外，如何對(duì)魚粉復(fù)配從而在達(dá)到抑制效果的同時(shí)被更多人所接受也是值得研究的方向。胡從玉等人在制備具有養(yǎng)胃健脾功效的功能性鮰魚粉產(chǎn)品時(shí)，就利用了中藥中開發(fā)利用具有健脾養(yǎng)胃功效的輔助產(chǎn)品，如山楂、葛根等。因此，在設(shè)計(jì)功能性鱘魚粉時(shí)，復(fù)配功能性的輔助成分，不僅會(huì)對(duì)產(chǎn)品在風(fēng)味上加以補(bǔ)充，同時(shí)還在功效上得以對(duì)產(chǎn)品進(jìn)一步完善。

五、思考與展望

近年來，糖尿病發(fā)病率及患病率隨著人類生活方式的改變、人口老齡化進(jìn)程的加快而逐年增長(zhǎng)。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟最新數(shù)據(jù)顯示，2017年糖尿病患病率（20歲～79歲）估計(jì)為8.8%，2045年預(yù)計(jì)會(huì)達(dá)到9.9%。我國(guó)糖尿病患者數(shù)已達(dá)1.096億，居全球首位。因此有效的控制、診斷、管理和教育對(duì)糖尿病患者來說十分重要。近些年，有關(guān)糖尿病的研究得到不斷發(fā)展，抗II型糖尿病的藥物和功能性產(chǎn)品也在不斷發(fā)展。開發(fā)天然的II型糖尿病抑制劑，可以有效的控制病情發(fā)展，同時(shí)進(jìn)一步促進(jìn)食品工業(yè)的發(fā)展。

中國(guó)是世界上魚類品種最多、分布最廣、資源最為豐富的國(guó)家之一。魚類深加工后的主要副產(chǎn)物—魚皮和魚骨中均富含膠原蛋白，可作為天然優(yōu)質(zhì)膠原蛋白來提取原料，有很好的研究和開發(fā)前景。DPP-IV抑制劑作為II型糖尿病的一種新型療法，是很有潛力的研究領(lǐng)域，與魚類副產(chǎn)物特性相結(jié)合，值得繼續(xù)開發(fā)。