分子育種技術(shù)在肉牛繁育中的應(yīng)用與研究進(jìn)展

丁麗艷 韓永勝 李同豹 丁得利 李平

（黑龍江省畜牧研究所 161005）

自二十世紀(jì)八十年代以來，隨著信息技術(shù)和分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，動物分子育種技術(shù)的研究取得了一系列突破性的進(jìn)展，動物育種技術(shù)已逐漸從宏觀的群體水平進(jìn)入微觀的分子水平，隨著動物分子育種理論基礎(chǔ)不斷完善，應(yīng)用技術(shù)不斷成熟，各種現(xiàn)代生物技術(shù)的綜合應(yīng)用，肉牛分子育種工作取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。

1 分子育種技術(shù)在肉牛品種間親緣關(guān)系診斷的應(yīng)用

應(yīng)用動物分子診斷技術(shù)能夠檢測各品種牛間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。Kierstein等[1]應(yīng)用線粒體分析不同來源水牛品種mtDNA D-loop序列發(fā)現(xiàn)，128個多態(tài)位點(diǎn)和36個mtDNA單倍體，分析表明，沼澤型水牛和河流型水牛馴化地點(diǎn)都可能是亞洲次大陸。Tu等[2]用分子診斷技術(shù)分析了牦牛mtDNA多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，牦牛與普通牛多態(tài)性區(qū)別明顯，依此估測到牦牛和普通牛祖先分化時間大約相差十萬年。寧素恒[3]分析牛乳鐵蛋白基因 (LF)同源進(jìn)化關(guān)系牛LF基因與馬的親緣關(guān)系最近。孟彥[4]采用SSCP方法對11個中國地方黃牛個體線粒體DNA D-loop序列和12S rRNA基因的多態(tài)性研究表明，日本黑牛、安格斯牛和海福特牛親緣關(guān)系較近，而西門塔爾牛、蒙古牛、延邊牛親緣關(guān)系較近。

2 分子育種技術(shù)在肉牛生長發(fā)育相關(guān)性狀基因診斷的應(yīng)用

肉牛的生長發(fā)育候選基因的研究涉及肉牛的體重、體高、體長、十字部高、腰角寬和日增重等，主要包含ACAN、POU1F1、LPL、GH、IGF、DGAT2等基因。

ACAN是核心蛋白聚糖的一種，是牛矮小癥狀的主要候選基因。Cavanagh等[5]發(fā)現(xiàn)，攜帶ACAN基因的牛在生長過程中表現(xiàn)侏儒癥。POU1F1基因在牛胚胎分化和生長發(fā)育過程中具有重要的作用，通過促進(jìn)GH、PRL和TSHβ及自身基因的轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)對牛生長發(fā)育等性狀的調(diào)控，促進(jìn)相關(guān)基因細(xì)胞系的生長和發(fā)育[6]。劉波等[7]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，POU1F1-E6H基因座與秦川牛的體重、體尺等生長性狀之間存在相關(guān)性，胸圍、十字部高指標(biāo)相比，AB和BB基因型個體顯著高于AA型個體，且相關(guān)基因與育肥性狀關(guān)系較大。LPL是一種脂肪分解酶，在脂蛋白中的載脂蛋白C2的輔助和催化下，LPL在脂類代謝和運(yùn)輸中發(fā)揮著重要作用。邱國宇[8]利用秦川牛和南陽牛為研究對象，研究LPL基因多態(tài)性與牛生長發(fā)育性狀的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，秦川牛雜合子 （AB）型基因，在體重、體高、十字部高、體斜長、胸圍和尻長指標(biāo)上顯著高于純合子 （AA和BB），而南陽牛雜合子 （AB）個體在初生重指標(biāo)上顯著高于純合子（AA、 BB） 個體。

GH是由腦垂體前葉細(xì)胞分泌的一種單一肽鏈的生長激素，它能調(diào)節(jié)牛的所有組織和細(xì)胞的生理功能，控制著牛的生長激素分泌水平和生長發(fā)育。高雪等[9]對GH基因研究表明，GHP3即第5外顯子2141 bp處和3'的GH-P4位點(diǎn)顯著影響牛的體重、體高、體斜長、胸圍和肉用指數(shù)。IGF是一種生長激素依賴性多肽，它可以促進(jìn)蛋白同化和有絲分裂作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增生及分化，IGF有IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ兩種類型。IGF-Ⅱ調(diào)節(jié)胚胎時期的發(fā)育，IGF-Ⅰ則調(diào)節(jié)出生后的個體生長和發(fā)育。DGAT2是合成甘油三酸酯過程中的關(guān)鍵酶，在脂肪代謝、脂類在組織中的沉積、腸道脂肪的吸收中發(fā)揮重要作用。張爭鋒等[10]研究南陽牛DGAT2基因第6內(nèi)含子多態(tài)性與體重、體尺性狀的關(guān)系，結(jié)果表明2歲體重、6月齡體高、6月齡到2歲的胸圍和體斜長相比，AA基因型南陽牛個體顯著地高于雜合基因型AB。

3 分子育種技術(shù)在肉牛胴體和肉質(zhì)相關(guān)性狀基因診斷的應(yīng)用

隨著生活水平的提高，人們對肉質(zhì)的要求越來越高，對肉質(zhì)性狀基因的研究成為肉牛育種工作中的一個重點(diǎn)。主要衡量指標(biāo)有胴體重、大理石花紋等級、眼肌面積、背膘厚度、瘦肉率、嫩度、肌肉酸堿度、肌肉剪切力等，主要相關(guān)基因有MSTN、 calpains、 FABPs、 MyoD1、 PRKAG3、 DHCR24、 CS、PPP1CB等。

MSTN基因突變可使牛出現(xiàn)雙肌性狀，在同一飼養(yǎng)條件下，雙肌牛產(chǎn)肉性能是普通牛的1.3倍，且骨骼較細(xì)，肌肉發(fā)達(dá)、瘦肉率高、肉質(zhì)細(xì)嫩。王嬌嬌[11]以遼育白牛為研究對象，對MSTN基因進(jìn)行分析表明遼育白牛MSTN基因在不同組織中具有表達(dá)差異性，其中肌肉中表達(dá)量最高。鈣激活蛋白酶（calpains)是含巰基的蛋白酶，主要位于肌纖維附近和肌質(zhì)網(wǎng)膜上，在動物屠宰后的肉成熟過程中起著著色的作用，μcalpaind能分解肌肉細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，使肌肉在此過程中達(dá)到嫩化作用。脂肪酸結(jié)合蛋白 （FABPS）在脂肪酸生成過程中參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸，加強(qiáng)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)散，參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的攝取，促進(jìn)細(xì)胞膜吸附脂肪酸，調(diào)整細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的濃度[12]。

MyoD1基因參與動物體多種分化細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌細(xì)胞的生產(chǎn)過程，是骨骼生長和再生過程的一個轉(zhuǎn)化因子，影響肌肉組織結(jié)構(gòu)的表達(dá)。黃萌等[13]以秦川牛、魯西牛和西門塔爾牛為研究對象，利用PCR-RFLP法分析MyoD1基因多態(tài)性與相應(yīng)牛個體的胴體性狀關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明，MyoD1基因C1867T位點(diǎn)對肉牛的背膘厚、大腿肉厚度的影響差異極顯著。PRKAG3是蛋白激酶 （AMPK）的r3亞基構(gòu)成的三聚體，具有肌肉特異表達(dá)的特性，通過對7個品種牛的PRKAG3基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)第4內(nèi)含子存在兩處突變，且不同基因型對應(yīng)的嫩度性狀差異顯著，同時也影響牛肉的pH和色澤[14]。

尹璐[15]以中國西門塔爾牛為研究對象，利用PCR-RFLP法分析DHCR24基因的多態(tài)性，通過對445頭牛進(jìn)行基因型檢測，分析與肉質(zhì)和胴體性狀的相關(guān)性。試驗(yàn)結(jié)果表明，多種肉質(zhì)和胴體性狀在DHCR24基因外顯子9的不同基因型之間有顯著差異，雜合子GA基因型個體與大理石花紋、后蹄重和脂肪顏色性狀具有顯著相關(guān)性；純合子GG基因型個體與背膘厚、大腿肉厚、后腿圍、眼肌面積和腰部肉厚性狀具有顯著相關(guān)性。田靜[16]用95頭西門塔爾牛為試驗(yàn)材料，以CS（檸檬酸合成酶基因）為候選基因，采用PCR-RFLP的方法分析基因外顯子3的遺傳多態(tài)性與西門塔爾牛肉質(zhì)性狀的相關(guān)性，結(jié)果表明，CS基因第三外顯子第206bp處存在G/A突變，該基因多態(tài)性與脂肪顏色呈顯著相關(guān)，AA型顯著高于BB型，對其他性狀的影響差異不顯著。姜穎[17]研究PPP1CB基因與肉質(zhì)相關(guān)性分析表明，PPP1CB基因第一內(nèi)含子第14 434bp堿基處存在C/T基因突變，該基因多態(tài)性與屠宰率也呈顯著相關(guān)，對其他性狀的影響差異不顯著。

4 分子育種技術(shù)在肉牛繁殖相關(guān)性狀基因中診斷的應(yīng)用

繁殖性狀是牛育種中一個重要的性狀，繁殖性能的高低直接影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。繁殖性狀涉及牛的雙胎性能，一般自然狀態(tài)下，牛為單胎動物，雙胎率只有0.15%左右。牛的繁殖性狀候選基因主要包括FSHR、LH、GDF9、RXRG、GnRH等。

FSHR為促卵泡激素受體基因，是G蛋白耦合受體。雷雪芹等[18]以秦川牛單、雙胎母牛為對象研究FSHR基因的多態(tài)性，結(jié)果雙胎母牛的雙胎牛和單胎牛之間FSHR基因的第10個外顯子的突變率差異顯著。魏伍川等[19]也研究表明，F(xiàn)SHR基因與牛的繁殖性狀存在連鎖相關(guān)。LH是促黃體素基因，與促卵泡激素FSH協(xié)同促進(jìn)卵泡生長成熟，參與內(nèi)膜細(xì)胞合成雌激素，誘發(fā)動物排卵，促進(jìn)黃體生成，LH由α和β兩個亞基因構(gòu)成。劉繼豐等[20]發(fā)現(xiàn)，LHβ不同基因型西門塔爾牛和夏洛牛的凍精畸形率和射精量顯著不同，這表明LHβ基因是影響精液品質(zhì)的一個主效基因。GDF9即生長分化因子9基因，是卵母細(xì)胞分泌的生長因子，調(diào)節(jié)卵巢卵泡的生長和分化，對動物繁殖起著重要作用。張路培等[21]以魯西黃牛為研究對象發(fā)現(xiàn)，在GDF9的3'UTR缺失突變，且雙胎牛的B等位基因頻率顯著高于單胎牛。

RXRG即視黃酸X受體γ基基因，參與上皮細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、胎兒發(fā)育等作用。RXRG基因定位于牛的3號染色體上，在肌肉中完全表達(dá)。黃萌等[22]研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型魯西單、雙胎牛RXRG基因位于3'UTR多態(tài)位點(diǎn)差異極顯著，這表明RXRG基因與魯西牛雙胎性狀具有密切相關(guān)性。于影等[23]報道GnRH即促性腺激素釋放激素，與特異性受體 （GnRHR）結(jié)合后，通過調(diào)節(jié)LH和FSH的水平來刺激性激素的產(chǎn)生、卵泡和精子的發(fā)育，從而調(diào)控卵巢和睪丸的功能，因此在繁殖中起到重要作用，外源GnRH可以促進(jìn)具有繁殖障礙母牛的妊娠。

5 結(jié)語

雖然分子育種技術(shù)在牛的品種間親緣關(guān)系的診斷，生長發(fā)育、胴體和肉質(zhì)、繁殖性狀相關(guān)基因的診斷方面取得了一定的進(jìn)展，但分子育種技術(shù)的研究還不夠完善，許多功能基因的研究只限于局部的某一片段，還缺少該功能基因的全部基因序列的研究，且不能作為獨(dú)立的育種技術(shù)進(jìn)行應(yīng)用。但隨著分子生物技術(shù)的不斷提高，研究的不斷深入，分子育種技術(shù)基礎(chǔ)將會越來越完善，應(yīng)用條件將日臻成熟，分子育種技術(shù)必將在肉牛育種中廣泛應(yīng)用，在育種中發(fā)揮出重要作用。