山羊MSTN基因研究及其在甘肅本地山羊的應用

楊軍祥

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所 744000）

轉化生長因子β(transforming growthfactor-β，TGF-β)超家族成員廣泛分布于脊椎動物體內[1]，在調節(jié)骨骼肌發(fā)育和維持機體穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的作用，該家族成員主要包括TGF-β抑制素、TGF-β活化素等。

肌肉生長抑制素 （myostatin，MSTN）在1997年被美國科學家McPherron首次發(fā)現(xiàn)，屬于生長分化因子β超家族成員。MSTN是近年來發(fā)現(xiàn)具有負向調控作用的因子，該基因的突變可使MSTN活性降低或者喪失，從而促使骨骼肌更好地生長發(fā)育，出現(xiàn) “雙肌臀”。目前，研究人員已經根據(jù)該基因培育出了經濟效益佳的肉畜品種，如作為終端父本的 “雙肌臀”肉牛，在生產中產生了巨大的經濟效益，具有瘦肉率高、飼料報酬好和生長速度快等特點。

中國是世界上山羊存欄量最多的國家，也是世界上最大羊肉生產國。山羊以天然草料為主食，其肉質好、蛋白含量豐富、能量低，富含多種氨基酸和微量元素，且膽固醇含量低。畜產品瘦肉率的提高和肉品質的改善有利于優(yōu)化人們的膳食結構，尋找與畜禽生長性狀和肉質性狀相關的候選基因或遺傳標記，對品種改良具有重要意義。本文從山羊MSTN基因的結構、生物學特性、功能及作用機制等方面的研究進展入手，探尋MSTN基因與山羊生長性能及經濟性狀的關系，為甘肅本地山羊種質資源保護、開發(fā)和利用開辟新的途徑。

1 MSTN基因的結構

MSTN基因的cDNA（complementary DNA）是由1個可讀框和能編碼376個氨基酸的脫氧核糖核苷酸堿基序列構成，其中外顯子3個、內含子2個，而成熟區(qū)是其第3外顯子。MSTN基因具有TGF-β超家族成員的典型結構特征，即由52ku的前體蛋白質N-末端區(qū)和編碼12.5ku成熟肽的C-末端區(qū)構成[2]，在N-末端區(qū)與C-末端區(qū)之間存在1個蛋白酶解加工位點，經過2次蛋白酶解加工，除去信號多肽，切除前體蛋白質生成N-端前肽與C-端多肽，而C-端多肽又以—S—S—(二硫鍵)鍵相連形成二聚體，構成MSTN成熟蛋白分泌至血液循環(huán)，并與N-端前肽以非共價鍵形式形成LAP。

除以上所述之外，MSTN基因與TGF-β超家族成員還有下面4個共同點：（1）在信號肽的N-末端區(qū)附近有一個氨基酸殘基構成的疏水前體蛋白質核心； （2）MSTN蛋白質靠C-末端區(qū)的中間部位有一個保守的蛋白酶解加工信號 （RSSR，263-266位氨基酸）； （3）9個半胱氨酸殘基在C-末端區(qū)形成 “Cys Knot”結構； （4）分子之間的二硫鍵均能聚合形成二聚體，并和細胞膜上的受體結合，通過3種Sand蛋白介導，將信號傳入細胞，作用于靶基因的調控區(qū)。

Thomas等利用MSTN特異性抗體，在牛成肌細胞培養(yǎng)物的提取液中檢測到52ku的前體蛋白質、40ku的LAP，但沒有檢測到加工后的活性蛋白，這可能是因為成熟的活性蛋白被分泌到血液的緣故[3]。但在骨骼肌提取物中檢測到26ku的活性蛋白。而McPherron等則報道在CHO細胞表達的重組MSTN前體蛋白和成熟的活性蛋白分別為52和12ku，這種分子質量的差異可能是由于翻譯后修飾造成的[2]。

Gonzalez-Cadavid等證實，人的MSTN基因也由3個外顯子和2個內含子組成，位于染色體2q33.2，含有3個轉錄起始位點，轉錄產物為3.1kb的mRNA，編碼375個氨基酸的前體蛋白[4]。Ma等克隆了人MSTN基因包括5′端調控區(qū)在內的全長3.3kb片段，結果發(fā)現(xiàn)，MSTN啟動子序列含有對多種物質的生長反應元件，這些物質包括糖皮質激素、肌生長分化因子1、肌細胞增強因子2、核因子-B等，并發(fā)現(xiàn)在體外，地塞米松以一種劑量依賴的方式不僅可增強MSTN啟動子的轉錄活性且可增強內源性MSTN基因的表達[5]。

2 MSTN基因的生物學功能

MSTN基因的功能主要體現(xiàn)在抑制肌肉增肌和脂肪積累兩個方面，其具體的生物學功能包括以下幾個方面。

（1）MSTN基因對肌肉的生長起負向調控作用即抑制肌肉生長。Mcpherron利用基因敲除技術證明了MSTN基因突變后的小鼠肌肉重量增大[2]。目前已有學者研究證實，牛MSTN基因可以改變肌肉的組織構造，把MSTN基因鈍化，使骨骼和皮下脂肪間的肌肉相互抑制作用減弱 (即骨骼肌的激增)，因為未成熟的終止密碼子和蛋白的無功能表達引起1個多肽的平截，使MSTN基因不能被表達為功能蛋白質，從而出現(xiàn)臀部、胸及其中前端肌肉異常發(fā)達，且皮膚較薄的 “雙肌臀現(xiàn)象”。

（2）MSTN基因與肌肉再生有一定的關系。Wagner等利用MSTN基因完全突變的小鼠與肌肉萎縮型小鼠雜交發(fā)現(xiàn)，MSTN基因完全缺失的肌肉萎縮型小鼠與非缺失的萎縮性小相比更為強壯、肌肉更多，肌肉間的隔膜表現(xiàn)出更少的纖維樣變形，這表明MSTN基因缺失對肌肉再生有促進作用[6]。Taylor等用重組MSTN基因對鼠骨骼肌C2C12細胞進行檢測，結果表明，重組MSTN蛋白在C2C12肌細胞中能抑制或阻礙細胞的增生、DNA合成和蛋白質合成，證明MSTN基因可能通過抑制肌肉的再生控制肌肉的生長[7]。

（3）MSTN基因能使肌肉萎縮。Gilson等通過研究人慢性廢用性肌肉萎縮中MSTN基因mRNA的表達水平發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)病人的MSTN基因mRNA表達水平比正常人顯著高，同時其表達量與2A、2B型纖維量成反比，因此，得出MSTN基因是促使肌肉萎縮的因子[8]。

（4）MSTN基因抑制脂肪沉積。Zimmers等研究發(fā)現(xiàn)，給裸鼠腿部注射能穩(wěn)定表達MSTN的CHO細胞后，裸鼠全身骨骼肌出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，體內的白色脂肪也差不多完全消失，說明MSTN基因不僅能抑制肌肉的生長，還能參于體內脂肪的代謝，抑制脂肪積累，這在生產中有利于提高瘦肉率[9]。

3 MSTN基因多態(tài)性的研究進展

目前的研究結果表明，MSTN基因的功能在不同動物間高度保守。Lee將小鼠MSTN的保守C-末端編碼序列作為探針，對小鼠、大鼠、人、牛、豬、羊、雞、火雞、斑馬魚的MSTN cDNA進行克隆、測序，研究發(fā)現(xiàn)，各種動物的MSTN基因序列高度保守，其N-末端都有分泌必需的信號肽序列，都有類胰蛋白酶作用水解加工位點 (RSRR)，都含有TGF-β超家族的富含半胱氨酸的保守區(qū)，且小鼠、大鼠、人、豬、雞、火雞的水解加工位點后的C-末端序列完全一致，同源性為100%，而牛、綿羊的成熟蛋白中也僅有l(wèi)～3個。

劉錚鑄等采用限制性內切酸酶Mnl I對山羊MSTN基因的379bp的擴增產物進行PCR-SSCP多態(tài)性分析，證實山羊內含子2、外顯子3區(qū)域存在多態(tài)性[10]。孟詳人等利用PCR-RFLP技術對11個綿羊品種MSTN基因非編碼區(qū)進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)存在3種基因型CC型、CT型和TT型，且3種基因型在11個綿羊品種中的分布差異極顯著 （＜0.01）[11]。劉錚鑄等采用PCR和直接測序的方法對我國9個地方綿羊品種和1個引入品種共計60個個體進行MSTN基因內含子2和外顯子3的多態(tài)性檢測及單倍型分析，共發(fā)現(xiàn)15SNPs，全部存在于內含子2中，同時檢測到12種單倍型，并推測單倍型VIII可能與綿羊的產肉性能有關[12]。朱紅剛等采用PCR-RFLP方法對67只貴州小香羊MSTN基因內含子2和外顯子3進行了多態(tài)性分析[13]。結果表明，所擴增內含子2中存在Bsp1286I的酶切多態(tài)位點，共檢測到3種基因型AA型、AB型、BB型，其中AB為優(yōu)勢基因型；所擴增內含子2和外顯子3中存在BstBI酶切多態(tài)位點，雜合型 （CD）為優(yōu)勢基因型，純合野生型 （CC）和純合突變型 （DD）為非優(yōu)勢基因型，D等位基因為優(yōu)勢基因。

由此可見，山羊的MSTN基因與其他動物MSTN基因相似，具有一定程度的保守型，其多態(tài)性主要集中在內含子2和外顯子3區(qū)域，該基因對于家畜肌肉的生長影響較大。

4 MSTN基因調控機制的研究

MSTN基因對肌肉生長負調控的作用機制至今尚未完全清楚，目前的研究結果認為，其作用機制有以下途徑。

根據(jù)TGF-β超家族成員信號傳導途徑，推測MSTN基因抑制肌肉生長的作用機理：MSTN基因在信號轉導過程中需要Ⅰ型 （TβRⅠ）和Ⅱ型 （TβRⅡ）受體的異二聚體復合物。MSTN基因C-端的半胱氨酸二聚體首先與TβRⅡ型受體結合，然后再與TβRⅠ型受體結合，于細胞表面處形成異源聚合體，通過TβRⅡ型受體激酶的活性，導致TβRⅠ型受體CT區(qū)域發(fā)生磷酸化，活化的TβRⅠ型受體可暫時與胞漿內Smads家族中的Smad2、Smad3結合，并激活C-端SSXS區(qū)域使絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化。最后與無磷酸位點Smads家族中的Smad4形成異源聚合物，進入細胞核中，導致生肌調節(jié)因子MyoD磷酸化過程受阻，阻止了與E-box位點的結合，這個E-box位點是其堿性區(qū)域和位于成肌細胞調控區(qū)內肌動蛋白啟動子的轉錄因子的結合位點，干擾有活性MyoD-E-box形成特定的肌肉蛋白質，從而抑制成肌細胞向肌細胞分化，阻礙肌肉的形成。

5 MSTN基因在甘肅本地山羊種質資源保護和開發(fā)利用上的前景

隴東黑山羊是甘肅省優(yōu)良的地方山羊品種，具有抗逆性強（耐寒、耐旱），肉質優(yōu)良 （羊肉鮮嫩，膻味輕，口感佳），適應性好 （耐粗放管理、耐粗飼）等優(yōu)點。隴東白絨山羊是以隴東黑山羊為母本，引進遼寧絨山羊和內蒙古白絨山羊做父本，經過長期的雜交選擇培育而成的以絨用為主的山羊品種。近年來，由于盲目引種和放任本交，使得隴東黑山羊和隴東白絨山羊的血統(tǒng)混雜、生產性能嚴重退化，純種飼養(yǎng)量下降，甚至處于瀕危狀態(tài)，種質資源保護迫在眉睫。為了保護、開發(fā)、利用這些優(yōu)良的地方品種，基層畜牧工作者和科研人員進行不懈的努力，隨著現(xiàn)代生物技術的普及、地方畜牧從業(yè)者理論技術的提升和基礎條件的改善，利用分子標記技術進行優(yōu)勢基因發(fā)掘和種質資源保護也提上了日程。

MSTN基因是調控肌肉生長發(fā)育的重要功能基因，也是重要經濟性狀的候選基因，具有廣闊的應用前景，其多態(tài)性與生產性能的關系等已成為當前的研究熱點。因此，在隴東黑山羊和隴東白絨山羊種質資源保護、開發(fā)、利用上，可以利用分子標記輔助選擇技術，研究其純種個體及其與布爾山羊等優(yōu)秀肉用山羊雜交后代MSTN基因的多態(tài)性和生長發(fā)育、產肉性能之間的關系，分析其群體遺傳結構，并確定其對羔羊體重、體尺及屠宰性能的影響，確定最佳雜交改良方案。同時，篩選出MSTN基因突變的個體，通過培育選擇出產肉率高、肉品質好和飼料報酬率高的優(yōu)秀個體作為種畜進行推廣，深度發(fā)掘地方優(yōu)良品種潛力，為隴東黑山羊和隴東白絨山羊種質資源保護、開發(fā)、利用工作開辟新的途徑。