銀杏葉發(fā)酵研究進(jìn)展△

楊芳，趙崇妍，屈青松，劉自堯，史新元

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488 )

銀杏GinkgobilobaL.為銀杏科，銀杏屬落葉喬木，有“活化石”的美稱[1]。銀杏葉為銀杏科植物銀杏的干燥葉，性平，味甘、苦、澀。歸心經(jīng)、肺經(jīng)。其主要成分為黃酮類、內(nèi)酯類、有機(jī)酚酸類、聚戊烯醇類、多糖類等，有效活性成分為黃酮類化合物和萜內(nèi)酯類物質(zhì)[2-3]。研究表明，銀杏葉具有降低血清膽固醇[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]等作用，對高血壓、冠心病等心血管疾病有一定的輔助治療作用[7-10]。銀杏葉含銀杏酸，銀杏酸是水溶性酸，具有一定的毒性，未經(jīng)炮制的銀杏葉中銀杏酸含量高達(dá)20 g·kg-1 [11]。隨著銀杏葉的用量逐年增加，銀杏葉的傳統(tǒng)炮制方式已經(jīng)不能滿足人類的需求，因其炮制后銀杏酸的含量仍較高，利用微生物與銀杏葉共發(fā)酵是近年來研究的熱點(diǎn)，微生物可利用和代謝銀杏葉中的成分，不僅能增加黃酮和內(nèi)酯等活性成分的含量，還能對銀杏酸進(jìn)行分解與轉(zhuǎn)化，達(dá)到增效減毒的目的，且銀杏葉中的某些成分還可促進(jìn)微生物的次生代謝，產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，從而開發(fā)銀杏葉新的藥用功能[12]。銀杏葉的發(fā)酵研究具有理論和現(xiàn)實(shí)意義，因此，本綜述對近年來國內(nèi)外對銀杏葉和微生物共發(fā)酵的研究進(jìn)行系統(tǒng)的總結(jié)，以期為銀杏葉的研究與應(yīng)用提供參考。

1 銀杏葉發(fā)酵過程中物質(zhì)成分的變化研究

1.1 發(fā)酵過程中新物質(zhì)的生成

銀杏葉中的某些成分可促進(jìn)微生物的次生代謝，產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，從而擴(kuò)展銀杏葉的用途[13]。詹欣[14]利用冠突散囊菌和銀杏葉進(jìn)行共發(fā)酵，通過低分辨質(zhì)譜和氫譜檢測，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物中有增強(qiáng)抗氧化能力的新物質(zhì)-咖啡因生成，表明發(fā)酵可增加銀杏葉的抗氧化能力。吳其飛等[15]利用猴頭菌和銀杏葉提取物共發(fā)酵，以抑制非酶糖基化反應(yīng)為指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對非酶糖基化反應(yīng)、α-葡萄糖苷酶的抑制作用明顯增強(qiáng)，推測在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了一些新物質(zhì)。董英等[16]篩選了11種菌株對銀杏葉粗提物進(jìn)行液體發(fā)酵，以體外抑制α-葡萄糖苷酶活為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)用猴頭菌發(fā)酵所得產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶活的抑制率最高，為92.1%，預(yù)測該發(fā)酵體系能產(chǎn)生某種新的活性物質(zhì)來抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

1.2 發(fā)酵過程中物質(zhì)含量的變化

銀杏葉中含有黃酮、萜內(nèi)酯等活性成分，同時(shí)也含有銀杏酸這樣的毒性成分，將銀杏葉與微生物進(jìn)行共發(fā)酵，利用微生物的代謝活動(dòng)，可起到增強(qiáng)銀杏葉中活性成分，降低毒性成分含量的作用[12]。

1.2.1 銀杏酸 銀杏葉經(jīng)過炮制后可制成銀杏葉茶，但長期飲用銀杏葉茶可引起陣發(fā)性痙攣、神經(jīng)麻痹、瞳孔放大、過敏等其它副作用，嚴(yán)重時(shí)會(huì)損害心臟[17]。因此，去除或降低銀杏葉中銀杏酸的含量是其被廣泛利用的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的光照法脫毒、超臨界CO2脫毒、中藥配伍脫毒法[18-19]不僅脫毒效率低而且有可能改變銀杏葉中的有效成分，用微生物發(fā)酵來降低銀杏葉制品中的銀杏酸，是新的生物脫毒法[20]。任金玫[21]利用冠突散囊菌和銀杏毛茶進(jìn)行共發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毒性成分銀杏酸下降了44.6%，活性物質(zhì)黃酮提高了3.14%。李銀亮等[12，22]利用冠突散囊菌發(fā)酵銀杏葉制作發(fā)酵茶，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵16 d后發(fā)酵茶中的銀杏酸比采摘時(shí)的銀杏葉中減少了74.4%。H Zhou等[23]以銀杏葉渣為底物利用熱帶假絲酵母和米曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵后基質(zhì)中銀杏酸含量由14.8 mg·g-1降至1.5 mg·g-1。

1.2.2 萜內(nèi)酯類和黃酮類 銀杏葉中的黃酮和萜內(nèi)酯類具有多種藥效作用，一些微生物可利用銀杏葉中的物質(zhì)，經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化成黃酮或萜內(nèi)酯類。秦俊哲等[24]利用冠突散囊菌和銀杏葉共發(fā)酵，采用HPLC檢測銀杏萜內(nèi)酯含量的變化，發(fā)現(xiàn)隨發(fā)酵時(shí)間延長銀杏總內(nèi)酯的含量略微下降，發(fā)酵10 d時(shí)其含量下降2.14%，與傳統(tǒng)的銀杏葉炮制方法相比總內(nèi)酯損失率大大降低。利用靈芝與銀杏葉進(jìn)行雙向液體發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)與未發(fā)酵的銀杏葉相比黃酮類物質(zhì)明顯增加[25]。將銀杏葉與黑曲霉進(jìn)行雙向固體發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)銀杏葉通過微生物代謝轉(zhuǎn)化后總黃酮含量提高5.77%[26]。將冠突散囊菌和銀杏葉共發(fā)酵，結(jié)果表明與未發(fā)酵的銀杏葉相比總黃酮含量增加了3.14%[21]。Weihua Qiu等[27]利用漆酶與銀杏葉共發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)銀杏葉中黃酮含量比未發(fā)酵基質(zhì)提高了24.11%。Jiahong Wang等[28]利用從古銀杏樹下的土壤中篩選出的Gyx086菌株與銀杏葉共發(fā)酵，結(jié)果表明發(fā)酵菌質(zhì)中黃酮量比未發(fā)酵銀杏葉基質(zhì)中高約170%。

1.2.3 其它 詹欣等[29]利用冠突散囊菌和銀杏葉共發(fā)酵的產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明未發(fā)酵的銀杏葉水提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯高于發(fā)酵后的產(chǎn)物，說明發(fā)酵后銀杏葉中的多羥基類抑菌物質(zhì)由于微生物的轉(zhuǎn)化而減少。

2 銀杏葉發(fā)酵產(chǎn)物藥理學(xué)研究

2.1 抗氧化

銀杏內(nèi)酯可以增強(qiáng)紅細(xì)胞 SOD活性，清除氧自由基，抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化[30-31]。Ismail AFM等[32]用黑曲霉發(fā)酵銀杏葉，將發(fā)酵液喂食經(jīng)γ-射線輻射過的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠腦組織中SOD、谷胱甘肽過氧化物酶活性和鈣水平顯著升高。詹欣等[14，33]將銀杏葉與冠突散囊菌共發(fā)酵，提取發(fā)酵物中的乙酸乙酯進(jìn)行抗氧化研究，以清除 DPPH 自由基能力、清除ABTS 自由基能力和還原Fe3+能力為指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵 11 d 后，發(fā)酵液中的抗氧化活性成分積累量最大。

2.2 降血糖

銀杏葉中的活性物質(zhì)黃酮具有降低血清膽固醇的作用，黃達(dá)眀等[34]用猴頭菌與銀杏葉提取物進(jìn)行共發(fā)酵，以四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠為模型進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與猴頭菌單發(fā)酵相比，猴頭菌與銀杏葉提取物共發(fā)酵的產(chǎn)物能顯著降低糖尿病模型小鼠的血脂、血糖水平。溫嘯等[35]以肥胖小鼠為模型，給肥胖小鼠喂食干酪乳桿菌與銀杏葉提取物混合液，發(fā)現(xiàn)與對照組相比肥胖小鼠的質(zhì)量降低了13.22%，血清中的總膽固醇降低了24.48%，甘油三脂降低了20.93%，血清中高密度脂蛋白膽固醇增加了167.85%，這些研究為開發(fā)預(yù)防和治療高脂血癥藥物提供了依據(jù)。

2.3 抗衰老、增強(qiáng)免疫力

許多研究表明銀杏葉有顯著的抗衰老、增強(qiáng)免疫力的功效，這些研究對抗衰老藥物、化妝品、保健食品等的開發(fā)有積極作用。郭敏等[36]研究用銀杏葉和牛蒡提取物為主要成分的發(fā)酵食品對小鼠衰老指標(biāo)的影響，結(jié)果表明喂食了發(fā)酵食品的小鼠肝、腦組織中單胺氧化酶的活性比對照組分別降低了36.7%、25.1%，丙二醛含量分別降低了19%、44.6%，而皮膚組織中羥脯胺酸含量和巨噬細(xì)胞吞噬活性分別高于對照28.6%和63.2%，有顯著的抗衰老作用。X Liu等[37]每天給肉仔雞喂食含0.3%凝結(jié)芽孢桿菌和銀杏葉共發(fā)酵產(chǎn)物的基礎(chǔ)日糧作為實(shí)驗(yàn)組，喂食含0.3%銀杏葉的基礎(chǔ)日糧作為對照組，定時(shí)采集肉雞血液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比血清IL-18和IFN-g水平明顯降低，說明銀杏葉的發(fā)酵產(chǎn)物能增強(qiáng)肉雞的免疫力。

2.4 抗菌、抗病毒

銀杏葉主要的抑菌物質(zhì)為多羥基類，包括多酚類、黃酮類、丹寧類等物質(zhì)，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌均有一定的抑制作用[29]。Shruti Shukla等[38]研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉發(fā)酵產(chǎn)物能夠抑制黃曲霉產(chǎn)生黃曲霉毒素B1、赭曲霉產(chǎn)生赭曲霉毒素A，從而抑制了黃曲霉和赭曲霉的生長。林標(biāo)聲等[39]利用產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌等益生菌發(fā)酵銀杏葉，發(fā)現(xiàn)銀杏葉和微生物的共發(fā)酵產(chǎn)物對仔豬的腹瀉病原菌有中度敏感作用，抑菌圈的平均直徑為12.6 mm，并且對豬傳染性胃腸炎病毒有一定的抗性。

3 銀杏葉發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)

隨著銀杏葉與微生物共發(fā)酵的研究越來越來多，其相應(yīng)的銀杏葉發(fā)酵產(chǎn)品也隨之增多。目前銀杏葉發(fā)酵產(chǎn)品應(yīng)用于食品、保健品和動(dòng)物飼料上。

3.1 在保健品和食品方面的應(yīng)用

李榮同等[40]利用菌核側(cè)耳東華虎奶-1號(hào)與銀杏葉粉進(jìn)行雙向固體發(fā)酵，發(fā)酵菌質(zhì)經(jīng)烘干研磨后制成的銀杏葉-菌核側(cè)耳復(fù)合發(fā)酵茶多糖含量高達(dá)10.96%。陳今朝等[41]以靈芝和乳酸桿菌為發(fā)酵菌株，銀杏葉為發(fā)酵基質(zhì)，研制出具有高營養(yǎng)價(jià)值和保健功能的新型靈芝銀杏葉酸奶。秦俊哲等[42]采用冠突散囊菌發(fā)酵銀杏葉制作銀杏茶，優(yōu)化其發(fā)酵條件，不僅保存了銀杏茶中的有效活性成分，降低了銀杏酸的含量，而且達(dá)到了銀杏茶脫苦去澀的目的。袁丹丹等[43]研究了銀杏葉的渥堆發(fā)酵工藝對銀杏葉茶口感的影響，在渥堆過程中，由多種微生物的共同作用，使銀杏葉的色香味都發(fā)生了變化，苦澀感消失，滋味醇和，更符合大眾的口味。

3.2 在飼料方面的應(yīng)用

銀杏葉富含黃酮類、有機(jī)酸、多糖、氨基酸等多種活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)不僅可作為動(dòng)物機(jī)體的營養(yǎng)物質(zhì)還發(fā)揮一定的防病抗病作用，被廣泛的應(yīng)用到動(dòng)物飼料添加劑中。用銀杏葉和黑曲霉生產(chǎn)飼料復(fù)合飼料，發(fā)酵后飼料中粗蛋白、總氨基酸分別提高106.09%、69.26%，纖維素酶和半纖維素酶的活力分別達(dá)到11.83、122.17 U·g-1，可作為一種新型綠色安全的飼料添加劑[26]。高樹峰[44]利用提取黃酮和萜內(nèi)酯后的銀杏葉渣為發(fā)酵基質(zhì)，分別與地衣芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，在肉雞日糧中分別添加 0.3%～0.6%的發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)兩種發(fā)酵產(chǎn)物均能改善肉雞的抗氧化功能，將固態(tài)發(fā)酵物使用于動(dòng)物飼料添加劑，有望消除或減少飼料添加劑抗生素的使用。

4 結(jié)語

從20世紀(jì)80年代莊毅提出“雙向發(fā)酵”技術(shù)[45]以來，將中草藥與微生物結(jié)合進(jìn)行發(fā)酵成為現(xiàn)代中草藥增效減毒研究的熱點(diǎn)。雙向發(fā)酵技術(shù)既能讓銀杏葉中的營養(yǎng)物質(zhì)被微生物生長所利用，又能使銀杏葉原有的化學(xué)成分在微生物體內(nèi)酶的催化下發(fā)生轉(zhuǎn)變，為銀杏葉的二次開發(fā)及新藥的研制等提供了嶄新的發(fā)展方向。由于銀杏葉中的成分比較復(fù)雜，且不同地區(qū)銀杏葉中化學(xué)成分的含量不同，和銀杏葉配伍的微生物種類也比較多，發(fā)酵工藝條件隨微生物的不同而異，迄今為止銀杏葉和微生物共發(fā)酵的研究已經(jīng)取得一定的成效，但大多集中在將發(fā)酵產(chǎn)物作為動(dòng)物飼料添加劑，醫(yī)藥用品幾乎沒有涉及，許多問題亟待解決。為了充分利用銀杏葉這一中藥材，今后的研究工作可從以下方面開展：首先篩選出既能大量降低銀杏葉中銀杏酸含量，又能提高銀杏葉中活性成分含量的微生物；其次對發(fā)酵過程中不同活性物質(zhì)的合成途徑、調(diào)控機(jī)制及其影響因素進(jìn)行研究，對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定銀杏葉和微生物發(fā)酵的工藝；第三對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行藥效及毒性評價(jià)，保證發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量和安全，為銀杏葉發(fā)酵產(chǎn)物在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。