新生兒耳聾基因檢測(cè)的應(yīng)用及臨床意義研究

梁桂蘭 梁潔瑩 鄒海珊 劉冬霞

中國(guó)的新生兒聽(tīng)力篩查工作最早開(kāi)始于20世紀(jì)80年代末,到了2007年,中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院將新生兒聽(tīng)力篩查內(nèi)加入了聾病易感基因篩查的新理念,第一次提出新生兒聽(tīng)力和基因聯(lián)合篩查整體實(shí)施流程以及操作系統(tǒng),取得滿(mǎn)意成績(jī)。60.00%的新生耳聾者主要因遺傳因素引起,在此其中2/3為遲發(fā)型耳聾［1］,該部分耳聾患者單憑聽(tīng)力發(fā)射法無(wú)法檢測(cè)出。70.00%為非綜合性耳聾,此類(lèi)疾病有著高度遺傳異質(zhì)性,和GJB3,GJB2,SLC26A4,線(xiàn)粒體12SrRNA基因突變存在相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)回顧性分析2016年1月～2017年1月本院收治的57例非綜合征性耳聾者為研究對(duì)象,全面分析新生兒耳聾基因檢測(cè)的應(yīng)用及臨床意義,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月～2017年1月本院收治的2000例新生兒為研究對(duì)象。均為出生3 d內(nèi)新生兒。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)審查,患者符合衛(wèi)計(jì)委最新頒布的關(guān)于耳聾診斷標(biāo)準(zhǔn)。爭(zhēng)取家屬知情同意之后,開(kāi)展相關(guān)調(diào)查,其中包含出生史、家族史、個(gè)人史、病患母親孕期體格檢查情況等。

1.2 方法 耳聾易感試劑盒(PCR+導(dǎo)流雜交法)(潮州凱普生化學(xué)有限公司)、PCR擴(kuò)增設(shè)備,全血基因組DNA提取試劑盒(潮州凱普生化學(xué)有限公司)。微陣列芯片掃描設(shè)備以及相關(guān)遺傳性耳聾基因芯片辨別系統(tǒng)。PCR+導(dǎo)流雜交法開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

PCR+導(dǎo)流雜交法能發(fā)揮芯片檢測(cè)高通量?jī)?yōu)勢(shì),可在一塊芯片中實(shí)現(xiàn)多個(gè)突變或者缺失基因檢測(cè),且結(jié)果判讀無(wú)需進(jìn)行昂貴設(shè)備或者復(fù)雜的序列分析,可直接觀察斑點(diǎn)顏色改變判讀結(jié)果。

①抽取2 ml新生兒臍帶血,放置在EDTA抗凝管內(nèi)。②使用廈門(mén)至善公司生產(chǎn)的全自動(dòng)全血核酸提取儀試劑盒,對(duì)全血樣本內(nèi)的DNA進(jìn)行提取,視為模板。③于PCR試劑Ⅰ中和試劑Ⅱ內(nèi)加入到提取完畢的待測(cè)樣本DNA 2 μl,總反應(yīng)體系為25 μl,開(kāi)展PCR擴(kuò)增,條件為：50℃15 min,95℃10 min,94℃15 s,58℃30 s,72℃30 s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),72℃5 min。④雜交：擇取規(guī)格為15 ml的塑料離心管,放入帶有編碼的膜條,放入A液5～6 ml和PCR產(chǎn)物質(zhì),擰緊蓋子,后將離心管擰松,以免在加熱時(shí)爆裂。將離心管放在沸水內(nèi)加熱10 min,后取出,擰緊蓋子,加入到雜交箱內(nèi)以44℃環(huán)境雜交1.5～4.0 h。在50 ml塑料管內(nèi)加入45 ml的B液,后放置在雜交箱內(nèi)/水浴箱中,預(yù)熱處理,直至44℃。⑤洗膜,移除模條,將其移植到裝有B液的管內(nèi),在44℃環(huán)境下輕輕搖晃洗滌15 min,每管溶液數(shù)量為45 ml。最多能洗滌4張膜。⑥顯色：將膜條浸泡在顯色液內(nèi),避光存放5～10 min,后在使用純水洗滌3～4次觀察結(jié)果,記錄好最終結(jié)果。⑦讀?。阂勒漳l中的突變情況,判讀結(jié)果。

1.3 質(zhì)量控制 每次實(shí)驗(yàn)時(shí),均設(shè)立正常對(duì)照和空白對(duì)照,操作和上述方式相同。

2 結(jié)果

2000例樣本內(nèi),先天性耳聾患兒57例,26例為SLC26A4 IVS7-2A＞G雜合突變；3例為線(xiàn)粒體12SrRNA 1555 A＞G均質(zhì)突變；28例為GJB2235delC/GJB2299delAT復(fù)合雜合突變。其中男40例,女17例。12例為兩側(cè)大前庭水管綜合征。

3 討論

耳聾為一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)身體健康的疾病。有統(tǒng)計(jì)證實(shí),在新生兒群體內(nèi),該疾病的發(fā)生率為1‰,在該部分群體內(nèi),大約有近半數(shù)的新生兒因遺傳性因素引起。在此其中有有75.00%～80.00%為隱性遺傳,18.00%～20.00%為顯性遺傳,其余為X-連鎖、線(xiàn)粒體或者染色體疾病導(dǎo)致?，F(xiàn)如今,人類(lèi)基因組計(jì)劃已經(jīng)完成,耳聾遺傳學(xué)取得了突破性進(jìn)展,諸多耳聾相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)定位克隆,在這種環(huán)境下,耳聾疾病的臨床基因診斷應(yīng)運(yùn)而生［3］。

遺傳性耳聾致病基因和相同基因突變點(diǎn)存在種族不同特征,甚至在相同種族,不同地區(qū)的類(lèi)型也不完全相同,其有著較強(qiáng)的種族特異性。有文獻(xiàn)指出,接近21.00%的耳聾者為GJB2基因突變,而SLC26A4基因突變者為14.50%。線(xiàn)粒體12SrRNA 1555 A基因突變?yōu)?.80%,C1494T基因突變者占據(jù)0.6%。證實(shí)GJB2和SLC26A4基因突變以及線(xiàn)粒體基因?yàn)橐疬z傳性耳聾常見(jiàn)基因類(lèi)型。在此其中,前兩者為隱性遺傳,而線(xiàn)粒體DNA則為母系遺傳。此次研究中,共計(jì)57例異常。其和既往研究結(jié)果并不完全相同,而GJB2基因并非本地區(qū)遺傳性耳聾的基因類(lèi)型,還需要進(jìn)一步研究證實(shí)［4］。

大前庭水管綜合征為新生兒常見(jiàn)內(nèi)耳畸形疾病。該疾病的主要癥狀為神經(jīng)性耳聾,疾病發(fā)生時(shí)間較晚,病情加重多和感冒、頭部外傷等存在相關(guān)性［5］。

早期研究證實(shí),可經(jīng)科學(xué)化指導(dǎo)以及限制活動(dòng),保存患者聽(tīng)力,基于此,檢測(cè)耳聾基因診斷法被逐漸應(yīng)用到臨床中。研究證實(shí)：SLC26A4基因突變和LVAS疾病發(fā)生存在因果關(guān)系,該基因突變會(huì)造成非綜合征性耳聾或綜合征性耳聾。其中12例為兩側(cè)大前庭水管綜合征。

研究指出［6-8］,線(xiàn)粒體A1555G突變會(huì)促進(jìn)氨基糖甙抗生素和12SrRNA基因結(jié)合,進(jìn)而引發(fā)氨基糖甙抗生素性耳聾,也能單獨(dú)引起感音性神經(jīng)性耳聾,其表型受到環(huán)境以及核基因背景、mtDNA單體影響。GBJ2基因突變?yōu)檫z傳性耳聾常見(jiàn)病因。由于該類(lèi)型基因相關(guān)病變者的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量正常,長(zhǎng)大后在適合于佩戴人工耳蝸。在植入人工耳蝸之后,患者的語(yǔ)言理解能力加強(qiáng),由此可見(jiàn),明確GBJ2基因突變型耳聾對(duì)于治療和預(yù)后有著相當(dāng)重要現(xiàn)實(shí)意義。

我國(guó)聾病分子流行病學(xué)調(diào)查研究證實(shí)：在中國(guó)聾人群體內(nèi)有4.4%的患者攜帶線(xiàn)粒體基因突變,其在使用以鏈霉素為主的氨基糖甙類(lèi)藥物之后出現(xiàn)聽(tīng)力下降,倘若患兒未能取得針對(duì)性醫(yī)學(xué)指導(dǎo),其家屬也很可能使用藥物致聾［9］。經(jīng)耳聾基因篩查,可及時(shí)發(fā)現(xiàn)以及預(yù)警攜帶藥物聾敏感基因個(gè)體,通過(guò)積極有效的指導(dǎo)后,倘若患者以及家屬能夠終身禁用氨基糖甙類(lèi)抗生素,就能避免藥物性耳聾的發(fā)生以及由此引起的聽(tīng)力殘疾。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可見(jiàn),中國(guó)遺傳性耳聾者中基因突變位點(diǎn)檢出率較高,其能全面滿(mǎn)足耳聾基因檢測(cè)需要,聯(lián)合現(xiàn)代產(chǎn)前診斷技術(shù),能全面防止耳聾胎兒出生,有助于減輕家庭負(fù)擔(dān),另外,這項(xiàng)技術(shù)還有著迅速,精準(zhǔn),高通量等優(yōu)勢(shì)具備較為廣闊的應(yīng)用前景。