番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒侵染辣椒揮發(fā)物成分分析及對(duì)西花薊馬行為反應(yīng)影響

鄭雪　陳勇　鄭立敏　鄭寬瑜　趙立華　陳永對(duì)　張潔

摘要：本試驗(yàn)以辣椒為寄主植物，研究西花薊馬對(duì)番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒侵染辣椒后的行為反應(yīng)，比較分析病毒侵染前后辣椒揮發(fā)物的異同。研究發(fā)現(xiàn)，與模擬接毒辣椒相比，西花薊馬偏好選擇機(jī)械接毒辣椒，但在產(chǎn)卵量上二者沒(méi)有顯著性差異。從模擬接毒和帶毒辣椒植株揮發(fā)物中共收集26 種化合物，含量差異顯著的物質(zhì)有14種。結(jié)果表明，西花薊馬對(duì)機(jī)械接毒辣椒植株有一定的偏好，番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒侵染能誘導(dǎo)辣椒植株揮發(fā)物種類和含量的變化。

關(guān)鍵詞：番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒；西花薊馬；辣椒；行為反應(yīng)；揮發(fā)物

中圖分類號(hào)：S433.89 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）11-0111-05

Abstract The effects of Tomato zonate spot virus （TZSV） infection on plant attractiveness for Frankliniella occidentalis and the volatile compounds of the treated plants （infected and non-infected by TZSV） were studies. The results showed that F. occidentalis was more likely to select TZSV-infected pepper plants， whereas there was no significant difference between TZSV infected and non-infected pepper plants in the fecundity of F. occidentalis. Twenty-six types of compounds were identified from the treated pepper plants， and 14 types had significant difference between the two kinds of treated plants. In conclusion，TZSV-infection could alter the varieties and content of host volatile compounds， resulting in attracting thrips vector.

Keywords Tomato zonate spot virus； Frankliniella occidentalis； Pepper； Behavioral responses； Volatile

番茄斑萎病毒屬病毒（Tospoviruses）在全球廣泛分布，為害除禾本科之外的幾乎所有糧食作物、蔬菜及觀賞植物，每年在全球造成數(shù)十億美元的經(jīng)濟(jì)損失。2008年在云南番茄上分離得到番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒（Tomato zonate spot virus， TZSV），其在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞病理學(xué)及基因組結(jié)構(gòu)方面具有布尼亞病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）病毒典型的特征，屬于西瓜銀色斑駁病毒（Watermelan silver mottle virus， WSMoV）血清組成員[1]。近幾年，TZSV在云南多個(gè)地區(qū)暴發(fā)流行，對(duì)煙草、番茄、辣椒等經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[2， 3]。前期研究表明，西花薊馬是TZSV的主要傳播介體之一。西花薊馬是本世紀(jì)初侵入我國(guó)的生物，隸屬于纓翅目（Thysanoptera），薊馬科（Thripidae），花薊馬屬（Frankliniella）。在昆蟲與植物協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，植物次生代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)在它們之間的化學(xué)通訊中起著決定性作用，誘導(dǎo)著昆蟲產(chǎn)生寄主定向、逃避、取食和選擇產(chǎn)卵場(chǎng)所、聚集等行為[4-6]。

機(jī)械損傷、昆蟲取食、植物病毒侵染等因素均可導(dǎo)致寄主植物產(chǎn)生一系列的生理生化反應(yīng)，最終致使代謝產(chǎn)物發(fā)生改變[7， 8]，這些變化可能會(huì)對(duì)媒介昆蟲產(chǎn)生有利或不利的影響，從而構(gòu)成了媒介昆蟲-病毒互作的內(nèi)在植物生理學(xué)基礎(chǔ)。作為病毒傳播介體的寄主植物，其體內(nèi)病毒誘導(dǎo)作用的變化在植物病毒的傳播及流行過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。植物病毒侵染會(huì)導(dǎo)致寄主植物揮發(fā)物成分、含量、植物激素、接毒、防御等相關(guān)酶活性發(fā)生改變，或?qū)χ参锔兄ハx危害并啟動(dòng)相應(yīng)的防御反應(yīng)產(chǎn)生干擾，從而影響媒介昆蟲對(duì)寄主植物的選擇性及適合度[9， 10]。

研究寄主植物揮發(fā)性次生物質(zhì)的組成成分、特性、對(duì)昆蟲的作用機(jī)理以及昆蟲對(duì)植物揮發(fā)物的行為反應(yīng)，將有助于闡明昆蟲對(duì)寄主植物的選擇機(jī)制。目前，關(guān)于蟲害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物對(duì)昆蟲影響的研究較多，主要集中在揮發(fā)性信息化合物的鑒定及功能的分析。有研究表明蟲害誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的揮發(fā)物對(duì)天敵有引誘作用，并且對(duì)部分植食性昆蟲有排斥作用[11-13]；但也有研究表明，植物揮發(fā)物亦是很多植食性害蟲尋找寄主植物的指示信號(hào)[14， 15]。

目前，關(guān)于植物病毒侵染導(dǎo)致寄主植物揮發(fā)物的改變對(duì)媒介昆蟲影響的報(bào)道較少。鑒于此，本試驗(yàn)就番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒侵染寄主植物辣椒后釋放的植物揮發(fā)物對(duì)媒介昆蟲西花薊馬行為反應(yīng)的影響進(jìn)行研究，并對(duì)TZSV侵染后的寄主植物辣椒揮發(fā)物的成分進(jìn)行鑒定分析，以期為進(jìn)一步闡明植物病毒-寄主植物-媒介昆蟲三者互作關(guān)系提供行為學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)ハx：西花薊馬采自云南省昆明市晉寧蔬菜大棚，實(shí)驗(yàn)室鑒定后用四季豆繼代培養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：（25±1）℃、相對(duì)濕度為70%～80%、16 h光照。

毒源：感TZSV的寄主植物番茄于2012年采自云南省元謀縣，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)后于-80℃條件下保存。

供試寄主植物：3～4片真葉期辣椒苗（辣椒種子為遵辣一號(hào)，由遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所惠贈(zèng)）于人工氣候箱內(nèi)[（25±1）℃ ，16 h光照]培育。模擬接毒處理：僅用蒸餾水涂抹至健康辣椒上。機(jī)械接毒處理：將毒源通過(guò)摩擦接種方法接毒至健康辣椒苗上，獲得感染TZSV植株（PCR檢測(cè)帶毒后供試）。

1.2 番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒對(duì)介體昆蟲西花薊馬選擇行為的影響試驗(yàn)

采用玻璃Y型嗅覺(jué)儀測(cè)定介體西花薊馬對(duì)感染TZSV辣椒葉片的選擇行為。Y型嗅覺(jué)儀臂長(zhǎng)20 cm，內(nèi)徑1 cm，兩臂夾角60°，管柄長(zhǎng)15 cm，管柄上離夾角10 cm處連有5 cm長(zhǎng)的釋放管。每管用硅膠管分別連接一味源瓶（250 mL帶磨砂口的容量瓶，分別內(nèi)置感染TZSV的辣椒葉片和健康葉片），進(jìn)入味源瓶的空氣經(jīng)活性炭過(guò)濾后再進(jìn)入蒸餾水加濕瓶，以凈化和增加空氣濕度，管柄處接入真空泵，調(diào)節(jié)抽氣速率為100 mL/min。試驗(yàn)在遮光的室內(nèi)進(jìn)行，頂燈為1盞15 W的熒光燈，測(cè)試環(huán)境室溫為（25 ± 2）℃，濕度70% ～ 75%。

行為測(cè)定方法：挑選50頭健康活潑并經(jīng)過(guò)饑餓處理4 h的西花薊馬成蟲，接到Y(jié)型管基部，觀察其5 min內(nèi)的行為選擇反應(yīng)，當(dāng)西花薊馬越過(guò)某一側(cè)臂的1/3并做一定時(shí)間的徘徊停留，則視為選擇，5 min內(nèi)未進(jìn)入任何側(cè)臂，則記為無(wú)選擇，被排除在統(tǒng)計(jì)分析外。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次重復(fù)調(diào)換Y型管方向并用95%乙醇擦洗Y型管，烘干以消除味源殘留。記錄進(jìn)入兩臂內(nèi)西花薊馬的數(shù)量。

1.3 番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒對(duì)介體昆蟲西花薊馬產(chǎn)卵行為的影響試驗(yàn)

取20頭同期剛羽化的西花薊馬雌成蟲，單頭飼養(yǎng)于放有模擬接毒和機(jī)械接毒辣椒葉碟的培養(yǎng)皿中任其孤雌生殖產(chǎn)卵，將培養(yǎng)皿置于人工氣候箱內(nèi)[（25±1）℃，16 h光照）]。每天記錄孵化出的西花薊馬若蟲數(shù)量，至成蟲死亡，顯微鏡觀察葉碟中未孵化卵數(shù)。每2天更換一次放有模擬接毒和機(jī)械接毒辣椒葉碟。試驗(yàn)重復(fù) 5次。

1.4 寄主植物揮發(fā)物的提取和鑒定

分模擬接毒和機(jī)械接毒辣椒植株2個(gè)處理。試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。

各處理稱取15 g完整新鮮的葉片、莖干樣品，分別置于100 mL的采樣瓶中，瓶口用封口膜密封，待用。采樣瓶不能被裝滿，需預(yù)留頂空萃取空間。安裝萃取頭到手動(dòng)進(jìn)樣手柄。100 μm PDMS萃取頭和65 μm PDMS/DVB萃取頭均在250℃下老化30 min（首次使用前需要老化）。用固相微萃取裝置刺穿封口膜，插入采樣瓶中，固定手柄高度后，推出萃取頭，在頂空萃取30 min?？焖僖瞥鲚腿☆^立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口中，熱解析5 min進(jìn)樣，進(jìn)行GC-MS分析。GC-MS分析條件[16]為毛細(xì)管柱：極性柱DB-5MS，膜厚0.25 μm，長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.25 mm；氣譜條件：程序升溫，45℃保持3 min，每分鐘升溫5℃，至230℃，保留5 min；氦氣流速為1 cm/s。每次進(jìn)樣1 μL。進(jìn)樣口溫度230℃，連接線溫度180℃。不分流進(jìn)樣。數(shù)據(jù)處理：采用標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)和標(biāo)樣對(duì)照的方法對(duì)揮發(fā)物組分進(jìn)行定性，用揮發(fā)物的峰面積進(jìn)行相對(duì)定量比較。采用質(zhì)譜庫(kù)檢索寄主植物的揮發(fā)物成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒對(duì)介體昆蟲西花薊馬選擇行為的影響

Y型嗅覺(jué)儀器測(cè)試表明，TZSV對(duì)薊馬的選擇偏好性有較大影響（表1）。面對(duì)模擬接毒和機(jī)械接毒后寄主植物辣椒散發(fā)的不同氣味源，約13.4頭的西花薊馬選擇模擬接毒的辣椒，所占比例為26.8%，選擇機(jī)械接毒辣椒的西花薊馬數(shù)量高達(dá)32.2頭，占比達(dá)64.4%，二者之間均達(dá)到顯著性差異。結(jié)果表明感染TZSV植株（機(jī)械接毒）散發(fā)的氣味源對(duì)西花薊馬有較強(qiáng)的吸引作用，有利于西花薊馬獲毒，促進(jìn)病毒傳播。

2.2 番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒對(duì)介體昆蟲西花薊馬產(chǎn)卵行為的影響

由表2可以看出，模擬接毒與機(jī)械接毒的辣椒葉片對(duì)西花薊馬產(chǎn)卵量沒(méi)有顯著影響，分別為24.20頭和24.76頭。

2.3 番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒侵染對(duì)寄主植物辣椒揮發(fā)物成分及含量的影響

由表3可以看出，模擬接毒和機(jī)械接毒兩組處理共檢測(cè)出26種揮發(fā)性物質(zhì)，含量差異顯著的物質(zhì)有14種。其中，（z）-3-已烯醛、（e）-2-已烯醛僅在機(jī)械接毒辣椒中檢測(cè)到，而（e）-β-羅勒烯僅在模擬接毒處理中檢測(cè)到。

模擬接毒和機(jī)械接毒兩處理?yè)]發(fā)物含量最高的兩種化合物均為β-水芹烯和（Z）-3-己烯-1-醇，該兩種化合物總量均超過(guò)各自處理組的50%，揮發(fā)物含量排在第3 位的均為（+）-2-蒈烯。除此之外，其余單種化合物的含量均低于5%，但間傘花烴、α-水芹烯、2-乙基-呋喃、二甲基硫醚、α-蛇麻烯、1-戊烯-3-醇、正戊醇、（z）-1， 5-二烯-3-醇、異戊醛在模擬接毒和機(jī)械接毒兩組處理中的含量存在顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

植物揮發(fā)性次生物質(zhì)主要是植物的次生代謝物，這些次生化合物中的大多數(shù)對(duì)植物正常生長(zhǎng)發(fā)育并不是很重要，但在植物與昆蟲和螨類等節(jié)肢動(dòng)物相互關(guān)系中顯得非常重要，是形成植物氣味特征物質(zhì)的主體。在昆蟲與植物協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，植物次生代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)在他們之間的化學(xué)通訊中起著決定性作用，在昆蟲尋找識(shí)別寄主植物、產(chǎn)卵等過(guò)程中具有重要的通訊引導(dǎo)作用，揮發(fā)性物質(zhì)在每種寄主植物中的成分、含量不盡相同，但主要包括烴類、醇、醛、酮、酯、有機(jī)酸和萜烯類等幾類化合物[17]。

昆蟲對(duì)不同植物的取食或產(chǎn)卵選擇是昆蟲與植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中形成的重要生存策略，植食性昆蟲可利用植物傳達(dá)的信息通過(guò)嗅覺(jué)或者結(jié)合視覺(jué)共同識(shí)別寄主植物[18]。植物在遭受損傷或被昆蟲、微生物侵染后，作為一種直接或間接的防御信號(hào)，其揮發(fā)物的組成會(huì)產(chǎn)生明顯的變化，從而影響植食性昆蟲的行為。有研究表明，寄主植物在感染Tospoviruses代表種番茄斑萎病毒（TSWV）后，可以大量吸引介體薊馬到感病植物上取食[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模擬接毒的辣椒相比，64.4%的西花薊馬選擇帶毒植株，選擇模擬接毒辣椒的西花薊馬僅占26.8%，表明TZSV機(jī)械接毒至辣椒植株對(duì)西花薊馬有明顯的引誘作用，與Abe等[19]的研究結(jié)果相同。中國(guó)番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl China virus， TYLCCNV）和煙草曲莖病毒（Tobacco curly shoot virus， TbCSV）的侵染會(huì)導(dǎo)致傳毒介體B型、ZHJ1兩種生物型的煙粉虱在煙草和棉花上的平均產(chǎn)卵量顯著增多[20]，在本研究中，西花薊馬在模擬接毒的試驗(yàn)組中產(chǎn)卵量稍低于在機(jī)械接毒辣椒葉片上的產(chǎn)卵量，但二者之間沒(méi)有顯著性差異。造成這種差異的原因可能與寄主植物、不同種類病毒侵染后釋放的揮發(fā)物和媒介昆蟲不同有關(guān)。

本研究?jī)山M處理共鑒定出26種揮發(fā)性物質(zhì)，其中模擬接毒組檢測(cè)到24種，機(jī)械接毒組檢測(cè)到25種，兩組處理?yè)]發(fā)物均以β-水芹烯和（Z）-3-己烯-1-醇為主要成分，該兩種化合物總量均超過(guò)各自處理組的50%。與模擬接毒處理相比，機(jī)械接毒處理組揮發(fā)物成分新增加了（z）-3-已烯醛和（e）-2-已烯醛兩種成分，這與蟲害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物具有很高的多樣性和可變性的規(guī)律相似[15]，且間傘花烴、（+）-2-蒈烯、α-水芹烯、α-蛇麻烯等成分含量顯著上升，2-乙基-呋喃、二甲基硫醚、1-戊烯-3-醇、正戊醇、（z）-3-己烯-1-醇、（z）-1， 5-二烯-3-醇和異戊醛的含量顯著下降。有研究表明，大多數(shù)植物遭遇蟲害后均會(huì)釋放萜烯類化合物，通過(guò)頂空抽樣分析發(fā)現(xiàn)，與健康野生型番茄植株相比，受害野生型植株誘導(dǎo)了大量的揮發(fā)物產(chǎn)生，主要是萜烯類，包括 α-蒎烯、β-蒎烯和2-蒈烯等[11]，與本研究結(jié)果類似。萜烯類是很重要的植食性昆蟲誘導(dǎo)的植物抗性物質(zhì)，機(jī)械接毒后的辣椒植株誘導(dǎo)新增加了（z）-3-已烯醛和（e）-2-已烯醛，（+）-2-蒈烯、α-水芹烯和α-蛇麻烯的相對(duì)含量則明顯增加，這可能與辣椒植株受病毒侵染后啟動(dòng)了自身相應(yīng)的防御反應(yīng)有關(guān)。

植物病毒作為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵因子之一，對(duì)寄主植物和植食性昆蟲有重要的影響，其誘導(dǎo)寄主植物揮發(fā)物在引誘或驅(qū)避害蟲中的關(guān)鍵作用需要深入探討，對(duì)于誘導(dǎo)途徑還需從分子水平上揭示其機(jī)理。

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