基于RNAi技術(shù)抗黑條矮縮病水稻新品系的培育

朱文銀　徐建第　楊連群　姜明松

摘要：水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）由介體灰飛虱以持久性不經(jīng)卵方式傳播。該病毒引起的水稻黑條矮縮病分布范圍廣、危害重。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的植物抗病毒基因工程策略，已廣泛應(yīng)用于植物抗病毒研究中。本研究利用已構(gòu)建的包含P10 CP基因部分片段反向重復(fù)序列和生物安全性更高的標(biāo)記基因bar基因的RNAi雙元表達(dá)載體pRBSDV-CP3-bar，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得抗黑條矮縮病和抗除草劑的轉(zhuǎn)基因水稻植株，通過抗性篩選、PCR檢測及分子雜交分析，獲得2個(gè)抗RBSDV和Basta的穩(wěn)定品系，并對其田間抗性及農(nóng)藝性狀表現(xiàn)進(jìn)行了鑒定，為抗RBSDV水稻新品種（品系）的培育奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻黑條矮縮病毒；RNA干擾；反向重復(fù)序列；農(nóng)桿菌介導(dǎo)

中圖分類號：S511.035.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號：A 文章編號：1001-4942（2018）11-0023-05

Abstract Rice black-streaked dwarf virus （RBSDV） is transmitted by the small brown planthopper （SPBH，Laodelphax striatellus Fallen） persistently. Rice black-streaked dwarf disease is one of the most wide spread and severe virus diseases. RNA interference （RNAi） is an important gene silencing phenomenon and has been widely used in the transgenic breeding for improving crops viral resistantce. According to the principle of RNA interference mechanism， a new RNAi binary vector named pRBSDV-CP3-bar， was constructed including the inverted-repeat sequence of P10 CP gene partial fragment and the marker gene bar with higher biosecurity，and was used to transform rice callus mediated by Agrobacterium in order to obtain anti-RBSDV and herbicide-resistant transgenic rice plants. After analyzed by PCR and northern blot，two anti-basta and highly RBSDV-resistant rice varieties KRBSDV2 and KRBSDV6 were obtained.Their performance of field resistance and agronomy traits were investgated. It laid a foundation for the breeding of new rice varieties （lines） resistant to RBSDV.

Keywords Rice black-streaked dwarf virus； RNA interference； Inverted-repeat sequences； Agrobacterium-mediated

水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）是引起水稻黑條矮縮病的病原物，該病毒屬呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）成員之一[1]。RBSDV主要由昆蟲介體灰飛虱（Laodelphax striatellus Fallen）以持久性不經(jīng)卵方式傳播，除侵染水稻外，還能侵染玉米引起玉米粗縮病[2]。水稻受該病毒侵染后主要表現(xiàn)為植株矮小叢生，不發(fā)棵，葉片細(xì)小濃綠，葉背、葉鞘和莖稈有早期蠟白色、后期黑褐色的短條紋不規(guī)則突起，嚴(yán)重發(fā)病株不能正常抽穗。發(fā)病田塊一般減產(chǎn)10%～40%，重病田甚至顆粒無收[3-6]。近年來，在黃淮流域粳稻區(qū)由于耕作制度和耕種方式的變化，灰飛虱冬前蟲量基數(shù)逐年增長，由于田間雜草和禾本科作物可作為RBSDV的寄主，通過灰飛虱的食毒和傳毒，該病很有可能在黃淮流域粳稻區(qū)大發(fā)生，對水稻生產(chǎn)構(gòu)成新的威脅。江蘇、山東、河南等省份一直將參試水稻品種的黑條矮縮病抗性鑒定結(jié)果作為新品種審定標(biāo)準(zhǔn)的重要約束性指標(biāo)之一。目前生產(chǎn)上主要依賴化學(xué)農(nóng)藥控制介體灰飛虱來防治RBSDV，但由于灰飛虱的遷飛習(xí)性及傳毒的瞬時(shí)性，化學(xué)防治效果不明顯，且易造成環(huán)境污染。因此，選育抗病品種是防治水稻黑條矮縮病最為經(jīng)濟(jì)有效的方法。

RBSDV基因組分子量約占病毒粒子總分子量的15%～20%，其由10條雙鏈RNA（double strand RNA， dsRNA）片段組成，按照其在聚丙烯凝膠電泳上的遷移距離由小到大，依次命名為S1—S10[7]；S1—S10編碼蛋白功能已經(jīng)基本明確，主要是RNA 依賴的RNA 聚合酶、外殼蛋白、沉默抑制子等[8-10]。其中，S10編碼的63000蛋白質(zhì)（P10）為病毒主要外層衣殼蛋白（coat protein， CP）。P10蛋白質(zhì)在體外或酵母細(xì)胞內(nèi)都能通過N端230個(gè)氨基酸相互作用形成多聚體。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，純化的P10蛋白在溶液中主要形成三聚體。P10蛋白形成三聚體的結(jié)構(gòu)對于RBSDV病毒粒體衣殼的組裝、復(fù)制及病毒傳播具有重要作用[11]。

在種質(zhì)資源抗性篩選中，目前尚未發(fā)現(xiàn)對RBSDV病毒免疫的水稻材料。雖然少數(shù)水稻資源具有一定抗性，但由于微效基因作用效應(yīng)低，難以在水稻育種中利用[12]。若用常規(guī)方法培育抗病品種存在育種周期長、效率低，抗病基因與不良性狀連鎖等問題。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)改良現(xiàn)有作物、賦予作物對病毒的抗性，在植物抗病毒病工程中將發(fā)揮巨大作用，其中利用較多的是RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術(shù)，利用該方法能髙效、特異性地控制病毒病。

RNAi是指外源性或內(nèi)源性雙鏈dsRNA特異性結(jié)合并降解靶標(biāo)基因mRNA，從而達(dá)到沉默靶標(biāo)基因的效果，致使相應(yīng)的功能表型缺失[13，14]。RNAi的本質(zhì)是轉(zhuǎn)錄后的基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），發(fā)生沉默的基因轉(zhuǎn)錄仍然正常進(jìn)行，但轉(zhuǎn)錄的mRNA在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生了序列特異性降解，從而導(dǎo)致基因不能正常表達(dá)成蛋白質(zhì)[15]。dsRNA的形成存在多種可能的途徑，許多研究表明，在植物體內(nèi)產(chǎn)生dsRNA的最佳方法是轉(zhuǎn)化具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（hair-pin RNA，hpRNA）的外源基因，根據(jù)RNA干擾原理，發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的dsRNA將會(huì)介導(dǎo)靶標(biāo)基因mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)基因表達(dá)的抑制，使植株獲得病毒抗性。

RBSDV的CP基因編碼病毒的外殼蛋白，主要負(fù)責(zé)病毒顆粒組裝、復(fù)制等功能。本研究利用已構(gòu)建的包含CP基因部分片段（CP基因3′端部分序列，不編碼任何蛋白）的反向重復(fù)序列和bar基因（抗除草劑Basta）的RNAi雙元表達(dá)載體pRBSDV-CP3-bar，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻成熟胚獲得抗黑條矮縮病和抗除草劑的轉(zhuǎn)基因水稻植株，經(jīng)抗性鑒定、PCR檢測及Southern blot、Northern blot分析，篩選到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因水稻抗性株系且田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)良好，為抗RBSDV水稻品種（品系）的培育奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源及植物材料

帶RBSDV病毒的灰飛虱成蟲來自濟(jì)寧市魚臺(tái)縣麥田，用感病品種武育粳3號的幼苗（2～3葉期）飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為25～27℃，光照周期 16L∶8D。

轉(zhuǎn)基因受體品種為圣稻14，屬早熟中粳水稻品種。該品種高感黑條矮縮病，由本研究室保存。

1.2 菌株與試劑

本試驗(yàn)所用生物工程菌株包括大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α及農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

植物表達(dá)載體pRBSDV-CP3-bar及探針由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)朱常香教授惠贈(zèng)，包含CP基因部分片段反向重復(fù)序列、水稻PLD（phospholipaseD）基因的內(nèi)含子和標(biāo)記基因bar基因（圖1）。

PCR所用dNTPs、Taq DNA 聚合酶、HindⅢ、核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量（DL 2000 Plus、DNA Ladder Mix）均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Trizol購自 Invitrogen 公司、HybondTM-N+、Northern blot kit購自Roche；其他試劑除文中另有注明外，均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.3 遺傳轉(zhuǎn)化及抗性篩選

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將陽性克隆載體pRBSDV-CP3-bar轉(zhuǎn)入受體品種圣稻14中。參照姚方印等[16]的方法進(jìn)行水稻成熟胚愈傷誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)出的愈傷組織與已有的陽性農(nóng)桿菌菌液共培養(yǎng)后，用15 mg/L Basta進(jìn)行3次抗性篩選，經(jīng)誘導(dǎo)及分化，最后獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。

1.4 轉(zhuǎn)基因水稻總RNA與基因組DNA提取

利用傳統(tǒng)Trizol法提取水稻葉片總RNA，cDNA的合成參照楊杰等[17]的方法進(jìn)行。DNA提取采用CTAB法，參照Murray等（1980）[18]的方法進(jìn)行了部分改動(dòng)。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR分析

根據(jù)已發(fā)表的RBSDV的S10信息，其中CP基因在GenBank中注冊號為JN008880.1，蛋白注冊號為AEQ75482.1。我們在CP基因3′端附近設(shè)計(jì)引物（上海英俊生物技術(shù)公司合成），以轉(zhuǎn)化植株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段RBSDV-CP3為CP基因的部分序列，因整個(gè)全序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，擴(kuò)增困難，所以僅擴(kuò)增hpRNA的莖部分序列。目的片段擴(kuò)增長度為500 bp，引物序列為：RBSDV-CP3-F：5′-AAGTGCCACTAGTACTTCAAC-3′；RBSDV-CP3-R：5′-TTAATAGCCTGTCCCTATCAG-3′。

PCR 擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的 PPT 抗性檢測

水稻分蘗中期，于天氣晴朗時(shí)用棉簽蘸取濃度為1 g/L的除草劑Basta（有效成分PPT）涂抹轉(zhuǎn)化植株葉片長度1～2 cm，7 d后觀察葉片涂抹處是否黃化，鑒定轉(zhuǎn)化植株是否成功轉(zhuǎn)入目的基因。

1.7 黑條矮縮病抗性人工接種鑒定

轉(zhuǎn)基因植株的黑條矮縮病抗性人工接種鑒定參照周彤等[19]的方法進(jìn)行：帶毒灰飛虱循回時(shí)間為12～15 d，接種時(shí)間48～72 h，水稻接種苗齡0.5～2.5葉，有效接種強(qiáng)度4～20蟲/苗。根據(jù)發(fā)病率評價(jià)田間抗性水平。分級標(biāo)準(zhǔn)參照水稻條紋葉枯病抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。免疫：發(fā)病率為零；高抗：發(fā)病率0.1%～5%；中抗：發(fā)病率5.1%～15%；中感：發(fā)病率15.1%～30%；感病：發(fā)病率30.1%～50%；高感：發(fā)病率大于50%；后四個(gè)級別統(tǒng)一記為感病。

1.8 抗病轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot分析

將提取的總DNA經(jīng)Hind Ⅲ酶切后，轉(zhuǎn)移到HybondTM-N+尼龍膜，80℃固定2h。Southern雜交分析參照Sambrook等[20]的方法進(jìn)行。以RBSDV-CP3基因和bar基因?yàn)樘结?，采用隨機(jī)引物法合成，用[α32P]dCTP進(jìn)行標(biāo)記。

1.9 轉(zhuǎn)基因植株的Northern blot分析

對提取的轉(zhuǎn)基因植株總RNA 進(jìn)行Northern blot分析，參照朱俊華等[21]的方法。

1.10 農(nóng)藝性狀調(diào)查

待水稻成熟期對野生型植株和篩選到的抗性轉(zhuǎn)基因株系的產(chǎn)量相關(guān)性狀如株高、穗長、有效穗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重進(jìn)行調(diào)查，再用SPSS軟件對結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 T0代轉(zhuǎn)基因植株的Basta鑒定和PCR檢測

待遺傳轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因苗生長至6葉期，在葉片上涂抹除草劑Basta，7 d后調(diào)查顯示：共有9株呈陽性。用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR檢測，以野生型圣稻14為陰性對照，結(jié)果顯示，Basta鑒定表現(xiàn)為陽性的植株均可擴(kuò)增出500 bp的目的片段（hpRNA的莖部分），而野生型圣稻14中未擴(kuò)增出特異帶（圖2）。表明經(jīng)除草劑鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR均呈陽性，說明外源基因已整合到圣稻14的染色體基因組中。

2.2 T1代轉(zhuǎn)基因植株的RBSDV抗性檢測

轉(zhuǎn)化pRBSDV-CP3載體的T0代陽性植株自交結(jié)實(shí)，獲得T1代株系，利用葉片涂抹Basta 的方法，篩選出T1代陽性轉(zhuǎn)基因植株。每個(gè)株系各選取50株陽性植株，用帶毒灰飛虱接種RBSDV，以野生型圣稻14為對照。接種30 d后的調(diào)查結(jié)果顯示，有2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的RBSDV發(fā)病率在5%以下，遠(yuǎn)低于對照和其它轉(zhuǎn)化株系的發(fā)病率，表現(xiàn)為抗性株系（表1）。

2.3 抗病轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot分析

提取抗病轉(zhuǎn)基因植株KRBSDV2、KRBSDV6和野生型圣稻14的總DNA，經(jīng)HindⅢ酶切后，電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，分別用RBSDV-CP3基因和bar基因?yàn)樘结?，進(jìn)行Southern雜交。雜交結(jié)果（圖3）顯示，野生型圣稻14無任何雜交條帶，而KRBSDV2出現(xiàn)1條雜交帶，KRBSDV6出現(xiàn)2條雜交帶，表明外源基因已整合于水稻的基因組中，且在KRBSDV2中至少存在1個(gè)拷貝，在KRBSDV6中至少存在2個(gè)拷貝。此外，我們對獲得的這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻抗性株系加代，分別檢測了RBSDV-CP3基因和bar基因在這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植株后代群體中遺傳分離情況。結(jié)果表明，在所選擇的轉(zhuǎn)基因植株中，外源基因在轉(zhuǎn)基因水稻中遵循孟德爾遺傳分離規(guī)律，表明外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中能穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)。

2.4 T2代轉(zhuǎn)基因的Northern blot分析

為了分析轉(zhuǎn)基因植株中的靶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)和積累情況，以未接種病毒的野生型水稻作為對照，提取抗病和感病的轉(zhuǎn)基因植株葉片總RNA，分別用RBSDV-CP3基因和bar基因?yàn)樘结?，進(jìn)行Northern blot雜交。結(jié)果（圖4）顯示：轉(zhuǎn)基因植株均顯示特異性的雜交信號，而對照野生型水稻中沒有檢測到任何雜交信號。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在RNA上樣量相等的情況下，抗病轉(zhuǎn)基因植株中RNA的積累量明顯低于感病植株中RNA的積累量，表明轉(zhuǎn)基因植株對病毒的抗性與靶基因mRNA的積累量呈負(fù)相關(guān)。由此說明，轉(zhuǎn)基因植株所產(chǎn)生的抗病性是由RNA介導(dǎo)的，也暗示了病毒的復(fù)制在轉(zhuǎn)基因植株中受到明顯抑制，即病毒RNA可能發(fā)生了降解。

2.5 轉(zhuǎn)基因品系農(nóng)藝性狀分析

對轉(zhuǎn)RBSDV-CP3的兩個(gè)穩(wěn)定株系KRBSDV2、KRBSDV6的農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析，結(jié)果表明，兩個(gè)抗病株系與受體圣稻14在株高、穗長、有效穗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重等6個(gè)性狀上無顯著差異（表2）。說明這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系除抗病性較對照圣稻14有很大提高外，其它農(nóng)藝性狀較圣稻14相近，具有應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的潛力。

3 討論與結(jié)論

RNAi是一項(xiàng)高效沉默目的基因干擾特定生命過程的有效技術(shù)，作為新興的基因阻斷技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用到動(dòng)植物功能基因組和植物抗病研究中。Hayakawa等[22]將水稻條紋葉枯病毒（Rice stripe virus， RSV）外殼蛋白CP基因?qū)胨荆Y(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻對RSV有一定抗性。Shimizu等[23]對RBSDV基因組分P9-1進(jìn)行干擾，發(fā)現(xiàn)可以達(dá)到抗病效果?；谕瑯釉?，本研究利用已構(gòu)建的包含P10 CP基因部分片段反向重復(fù)序列和生物安全性更高的標(biāo)記基因bar基因的RNAi雙元表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織并獲得抗黑條矮縮病和抗除草劑的轉(zhuǎn)基因水稻植株。利用其育成的高代抗性株系的重要農(nóng)藝性狀與野生型無明顯差異，可為抗黑條矮縮病水稻新種質(zhì)的創(chuàng)制提供了很好的研究基礎(chǔ)。

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