白及種苗的最佳生長條件篩選

王躍華， 陳 燕， 周 歡， 劉 曼， 劉媛媛， 羅晴方

（成都大學(xué)， 四川 成都610106）

白及（Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.）為蘭科（Orchidaceae）白及屬（BletillaRchb.f.）多年生草本植物，以干燥塊莖入藥。具有收斂止血、清熱解毒、消腫生肌之功效［1］。常用于治療咯血吐血，外傷出血，癰疽腫毒，潰瘍疼痛，皮膚皸裂等癥［2］。隨著現(xiàn)代科技的不斷發(fā)展，白及作為傳統(tǒng)中草藥和觀賞植物被廣泛應(yīng)用，而且在化妝品的應(yīng)用中也日益受到重視［3］。然而由于過度采挖，導(dǎo)致其野生自然資源急劇減少。且白及種子在自然條件下極難萌發(fā)［4］，傳統(tǒng)分株繁殖的方式又因繁殖速度慢，繁殖率不高而難以滿足市場需求。因此，若能利用組織培養(yǎng)技術(shù)大量生產(chǎn)種苗，將為資源的可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。有關(guān)白及的種子萌發(fā)與組織培養(yǎng)研究已有不少報道［5－8］，田翠英等研究表明，細胞分裂素BA能促進白及幼苗的增殖，GA與番茄汁有利于其生根壯苗［9］；宋智琴等研究表明，香蕉泥、馬鈴薯泥、番茄泥與胡蘿卜泥4種有機添加物對白及組培苗生長的影響存在一定的差異，香蕉能顯著促進白及組培苗的生長發(fā)育，起到壯苗和增大球莖的作用［10］。而通過添加有機蕎麥添加物促進白及種苗生長的研究，目前未見相關(guān)文獻報道。本研究利用正交試驗對白及生長條件進行系統(tǒng)研究，在改變培養(yǎng)基成分的基礎(chǔ)上優(yōu)化培養(yǎng)條件，并且特別添加天然成分蕎麥，以期獲得白及快速生長的最佳條件，為白及快繁及大規(guī)模工廠化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 儀 器

SW－CJ－2F型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；YH－JZ－H接種器械滅菌器（上海宇涵生物科技有限公司）；LDZX－75KB立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.1.2 種 子

白及種子采集于四川省成都市都江堰市龍池鎮(zhèn)。10月中下旬種子變?yōu)辄S褐色時采集。采集后存于5℃冰箱中備用。

寧蕎1號、豐甜1號和西蕎2號蕎麥種子由成都大學(xué)國家雜糧加工技術(shù)研發(fā)中心種子儲藏室提供。

1.2 方 法

1.2.1 白及種子的選取和消毒

選取成熟的白及種子，首先在超凈工作臺上將種子裝入滅菌的離心管內(nèi)并加入0.1%的升汞（種子∶升汞＝1∶5）消毒11min，不斷搖晃離心管，使種子與升汞充分接觸。然后將升汞與種子混合液倒入500mL燒杯中加無菌水稀釋至500mL刻度線。最后用無菌膠頭滴管從燒杯中吸取種子和無菌水的混合液均勻滴加至培養(yǎng)基表面。

1.2.2 蕎麥添加物的制取

分別選用寧蕎1號、豐甜1號和西蕎2號3種蕎麥種子，經(jīng)48h的萌發(fā)生長后，選取胚根長度為1～2cm的蕎麥萌發(fā)種子，去掉胚芽上的種皮，用粉碎機加水（蕎麥胚芽∶水＝1∶1）粉碎制成蕎麥添加物。

1.2.3 實驗設(shè)計

采用4因素4水平的試驗，正交表選用L16（44）表頭設(shè)計。正交表中A，B，C，D對應(yīng)4因素：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、光照時間、蕎麥添加物、赤霉素濃度，各水平見表1。研究不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基、不同光照時間、不同種類的蕎麥添加物和不同濃度的赤霉素對白及幼苗生長的影響。

表1 白及種苗快速生長因素水平表

1.2.4 培養(yǎng)條件和數(shù)據(jù)分析

白及種子在溫度為（22±2）℃，光照強度為1 200～1 800lx的條件下培養(yǎng)50d后，統(tǒng)計白及苗的生長狀況，并測量出白及幼苗的生長高度。

使用正交助手Ⅱ完成正交試驗的設(shè)計和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白及幼苗快速生長的正交試驗結(jié)果

培養(yǎng)基的成分、添加物以及光照時間對植物的生長都有極其重要的作用。為了尋求白及幼苗的快速生長條件，本試驗設(shè)計了16組試驗，培養(yǎng)50d后，統(tǒng)計白及幼苗的生長狀況并測量幼苗高度，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，參試的16個組合中，15號組合A4B3C2D4表現(xiàn)較佳。通過觀察15號白及種子萌發(fā)和種苗的生長情況可知，白及種子在接入培養(yǎng)基10d后種子開始吸水膨脹，12d后吸脹變?yōu)辄S綠，15d后種子一端出現(xiàn)深色綠點，20d后種子圓球部分膨大，在解剖鏡下可見種子有綠點端長出1片子葉，種皮完全爆開，25d后解剖鏡下可觀察到，伴隨第1片子葉的增長，真葉開始萌發(fā)，經(jīng)過50d培養(yǎng)后白及苗高達14.18mm。

由表2極差分析結(jié)果可知，影響白及種苗生長高度因素的高低順序依次是：RC＞RB＞RA＞RD，即白及生長條件中影響幼苗生長的主要因素是添加物，其次是光照時間，再次是基礎(chǔ)培養(yǎng)基，影響最小的是赤霉素。根據(jù)各因素各水平所對應(yīng)指標(biāo)結(jié)果的平均值可以確定組合A1B3C2D1為最佳培養(yǎng)方案，即白及幼苗生長的最佳培養(yǎng)條件是光照12h，最佳培養(yǎng)基是1／4MS＋20g／L寧蕎1號。經(jīng)過驗證實驗可知，最佳培養(yǎng)方案條件下培養(yǎng)50d的白及苗高可達16.58mm。

表2 白及種苗快速生長正交試驗結(jié)果及極差分析

2.2 因素指標(biāo)分析

圖1 因素指標(biāo)效應(yīng)曲線

為了獲得直觀分析，根據(jù)試驗結(jié)果，以因素為橫坐標(biāo)，白及苗高為縱坐標(biāo)，作效應(yīng)曲線（圖1）。由圖1可知，白及種苗生長的最佳方案為A1B3C2D1，即白及幼苗生長的最佳培養(yǎng)條件為光照12h，最佳培養(yǎng)基為1／4MS＋20g／L寧蕎1號。各因素對白及苗高的影響次序為：添加物＞光照時間＞培養(yǎng)基＞赤霉素，在4個因素中蕎麥添加物對白及苗高的影響最大。3種蕎麥添加物中對白及苗高的影響次序為：寧蕎1號＞豐甜1號＞西蕎2號，寧蕎1號對白及苗高影響最大，平均苗高可達無添加物實驗組的2.49倍。

2.3 方差分析

進一步比較各因素對白及種苗生長的影響和探究4種因素之間的聯(lián)系，以白及幼苗高度為測定指標(biāo)，在極差分析的基礎(chǔ)之上進行方差分析，結(jié)果見表3。

從表3可見，本試驗設(shè)置的4個因素中，3個對試驗結(jié)果有顯著影響，其中2個對試驗結(jié)果有極顯著影響。因素 A 檢驗 值 F＝14.29，F(xiàn)0.05＝9.28，F(xiàn)0.01＝29.5，F(xiàn)0.05＜F＜F0.01，因而因素 A 對促進白及種苗的生長有顯著影響（0.01＜p＜0.05）；同理，因素B和因素C的檢驗值F均大于F0.01，因而因素B和因素C對試驗結(jié)果都有極顯著的影響（p＜0.01）；因素D的檢驗值F小于F0.05，因而因素D對試驗結(jié)果無顯著影響（p＞0.05）。比較4個因素的檢驗值可以得出FC＞FB＞FA＞FD，所以影響白及種苗生長高度的最主要因素是添加物，其次是光照時間，再次是基礎(chǔ)培養(yǎng)，赤霉素影響最小，此結(jié)果與極差分析的結(jié)果一致。

表3 白及種苗快速生長方差分析

3 結(jié)論與討論

應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)快速生產(chǎn)白及種苗是解決白及資源緊缺的重要方式之一。天然的有機添加物含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，能為植物生長提供一些生理活性物質(zhì)和補充微量成分，對其生長有顯著的促進作用。又由于其價格低廉、材料易得、制作簡便等優(yōu)勢而廣泛應(yīng)用于組培苗的規(guī)?；a(chǎn)中。本研究結(jié)果表明，3種蕎麥添加物中對白及苗高影響最大的是寧蕎1號，其次是豐甜1號，最后是西蕎2號。其中添加寧蕎1號實驗組的平均苗高可達無添加物實驗組的2.49倍，可見在培養(yǎng)基中添加蕎麥能有效促進白及種苗的快速生長。

熊雙麗等在苦蕎和甜蕎麥粉及麥殼中總黃酮的提取和自由基清除活性的研究中發(fā)現(xiàn)，苦蕎麥中總黃酮得率為2%～3%，甜蕎麥中總黃酮得率為1%～2%［11］；王靜霞等在蕎麥和商品苦蕎茶中總黃酮的含量測定中發(fā)現(xiàn)，苦蕎的總黃酮含量在13.67～21.56mg／g之間，甜蕎總黃酮含量在5.79～7.23mg／g之間［12］；唐宇等在蕎麥中黃酮含量的研究中發(fā)現(xiàn)，在28個苦蕎麥品種中，籽粒的黃酮含量平均值為2.02%，而20個甜蕎品種籽粒的黃酮含量平均值為0.23%［13］。上述研究均表明，苦蕎麥的黃酮含量遠遠高于甜蕎麥。本研究結(jié)果表明，添加蕎麥試驗組的白及顯著好于沒有添加蕎麥的試驗組，黃酮含量低的甜蕎麥（寧蕎1號和豐甜1號）比黃酮含量高的苦蕎麥（西蕎2號）對白及種苗生長的促進作用更強。因而筆者推測蕎麥添加物中對白及生長起促進作用的物質(zhì)并不是蕎麥中的黃酮類化合物。

張美莉在萌發(fā)蕎麥種子內(nèi)黃酮與蛋白質(zhì)的動態(tài)變化及抗氧化性研究中發(fā)現(xiàn)，蕎麥萌發(fā)后可溶糖含量呈上升趨勢，不同品種蕎麥可溶糖含量變化趨勢一致，但甜蕎可溶糖含量高于苦蕎［14］。馬元喜在不同土壤對小麥系生長動態(tài)的研究中發(fā)現(xiàn)，健壯的根孕穗期可溶糖含量為6%～8%，虛弱的根則為2.5%～3.5%，即可溶糖對植物的生長具有促進作用［15］。本研究中，可溶糖含量高的實驗組（寧蕎1號和豐甜1號）對白及種苗生長的促進作用明顯高于可溶糖含量低的實驗組（西蕎2號）。因而，筆者推測蕎麥添加物中的可溶糖促進了白及種苗的生長。

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