中國煙草種質(zhì)資源創(chuàng)新研究進展

王國平， 周東潔， 牛永志， 常愛霞， 肖江海， 鄭昀曄，2

（1.玉溪中煙種子有限責(zé)任公司， 云南 玉溪653100； 2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 云南 玉溪653100；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所， 山東 青島266100）

煙草種質(zhì)資源能夠為新品種選育和分子標(biāo)記、基因挖掘等基礎(chǔ)研究提供原材料，是育種的基礎(chǔ)，關(guān)乎到煙草事業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。種質(zhì)創(chuàng)新是豐富種質(zhì)資源的重要途徑，我國在種質(zhì)創(chuàng)新方面取得了較大的成就。煙草種質(zhì)資源庫搜集保存的種質(zhì)有5 267份（截止到2011年12月），是世界上保存數(shù)量最多的國家［1］，構(gòu)成豐富的遺傳背景。本文從雜交、誘變、細(xì)胞工程、轉(zhuǎn)基因以及分子標(biāo)記5個方面對我國煙草種質(zhì)創(chuàng)新成果進行闡述，并進一步作出展望，為今后的育種和種質(zhì)創(chuàng)新工作提供參考。

1 雜 交

雜交是種質(zhì)創(chuàng)新的最基本手段，對親本進行有性雜交或回交，通過系譜選擇、混合選擇等方式，培育出優(yōu)質(zhì)、抗病、高產(chǎn)的優(yōu)良新品種，其仍然是目前和今后相當(dāng)長時間內(nèi)新材料創(chuàng)制的主要方式。按照親本的親緣關(guān)系，雜交又可分為種內(nèi)雜交、科屬間雜交和遠緣雜交，種內(nèi)雜交不存在遠緣雜交不親和性，故為主要應(yīng)用方式。

1.1 種內(nèi)雜交

我國常規(guī)育種研究起始較早，但初有成效追溯到20世紀(jì)60年代［2，3］，總體上可以分為2個階段：80年代以前和80年代以后。80年代以前我國育成的品種主要有金星6007、凈葉黃、小黃金1025、DB 101、特字401、402以及革新系列、晉太系列、遼煙系列，春雷一號、二號，翠碧一號、永定一號、單育二號等。這些煙草品種三大主要親本為滕縣金星、特字400和大金元，其他品種基本都是以特字400及衍生材料特字401、特字402，滕縣金星的衍生材料金星6007為親本選育而成，其次以大黃金、小黃金以及部分地方品種厚節(jié)巴、煙變子、喬莊多葉等為親本材料選育而成［4］。80年代以后，從國外引進了優(yōu)質(zhì)烤煙 K 326、G 28、NC 82和NC 89等，我國主要依賴于這些親本雜交選育出眾多品種，同時創(chuàng)制了大批高世代品系，目前通過審定的有150余份，主要有中煙、云煙、湘煙、秦?zé)?、遼煙、安煙、豫煙、閩煙、鄂煙、龍江系列等［5，6］。經(jīng)過幾代人的不懈努力，我國的種質(zhì)資源數(shù)量不斷被刷新，為我國煙草事業(yè)的發(fā)展做出了重要貢獻。

1.2 遠緣雜交

遠緣雜交可以打破種屬間的界限，擴大遺傳變異，產(chǎn)生特異的雜種優(yōu)勢，因而是種質(zhì)創(chuàng)新的一條重要途徑。但遠緣雜交的最大障礙就是不親和性，不同的煙草品種間雜交和不同的雜交方式（正反交），其結(jié)實率和單果結(jié)籽數(shù)都存在顯著差異［7］。野生煙N.stocktonii和N.nesophila分別與小黃金1025、大黃金5210和大白筋599正交有較高的結(jié)實率，反交卻基本上不孕，在雜交花朵的花柄基部涂以20～100mg／L濃度的2，4－D、NAA 均可有效地提高雜交結(jié)實率［8］；云煙87與N.plumbaginifolia正交后代雄性敗育，但雌性可育，后代大部分外觀形態(tài)指數(shù)介于雙親之間，且具較強的黑脛病抗性，反交卻不結(jié)實［9］。此外，也存在研究報道不一致的現(xiàn)象。廖菊夠等［10］將 K 326分別與N.rustica和N.debneyi正反交，結(jié)果正交不結(jié)實，反交可以獲得種子，但萌發(fā)率較低；朱楠等研究表明，MSK 326 與 N.debneyi、N.rustica、N.alata 正 交 不親和 ，N .debneyi、N .rustic、N .stocktonii、N .repanda與 K 326反交，只有 N.debneyi 獲得萌發(fā)的種子［11］；姚恒等研究表明，N.rustica、N.repanda 和 N.stocktonnii與K 326、紅大、云煙87、云煙97雜交不親和，N.alata作為母本與栽培煙草雜交不親和，作為父本可以結(jié)實，但種子不萌發(fā)［12］。

1.3 科屬間雜交

不同科屬間的遠緣雜交可以創(chuàng)造出特異的種質(zhì)資源。我國先后利用普通煙草龍煙2號與曼陀羅進行屬間遠緣雜交，培育出含阿托品及莨菪烷生物堿的新型煙草，并通過無性與有性雜交相結(jié)合的方法克服不孕，獲得穩(wěn)定后代［13，14］。以同樣的方式，普通煙草78－04與藥用植物白花曼陀羅雜交育出的新型煙草品系長柄曼陀羅煙具有低糖、中高煙堿，含有東莨菪堿和阿托品等藥用成分的特點［15］。

2 細(xì)胞工程

細(xì)胞工程是克服遠緣雜交不親和的重要手段。在20世紀(jì)90年代，我國實現(xiàn)了NC 89和寧夏枸杞［16］、普通煙草與野生煙［17］、柳葉煙和大圓葉菠菜［18］等的不同科屬種之間的細(xì)胞融合。同時也篩選出大批優(yōu)良材料，夏鎮(zhèn)澳等［19］，宛新杉等［20］誘導(dǎo)融合普通煙草革新一號和龍葵的原生質(zhì)體，得到了細(xì)胞雜種，又經(jīng)5代選擇與培育，選出了新品系694－L。黃文川［21］鑒定了煙草種間體細(xì)胞雜交高代材料Z 14的性狀，其主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)良，高抗CMV和TMV；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所［22，23］將革新一號與黑老虎原生質(zhì)體培養(yǎng)成株后，用大白筋599和NC 82進行多年回交改良，選育出了品質(zhì)優(yōu)良，兼抗多種病害的TR新品系以及88－4等具有特殊香味的衍生烤煙新品系；同時又將普通煙與N.glauca細(xì)胞融合得到一個胞質(zhì)雜種TG－8，用G 28與之連續(xù)回交4代后，得到新胞質(zhì)雄性不育系86－6以及衍生雜交種92－7和92－8。此外，我國利用花藥離體培養(yǎng)的方式也培育出了單育一號、單育二號、單育三號、NC 89和皖煙一號以及烤煙特香型品種3002和3041。

3 誘 變

誘變能夠隨機突變基因組信息，從而改變植株的遺傳特性。其具有突變效率高、見效快等優(yōu)點，是種質(zhì)創(chuàng)新的又一重要手段。按照誘變方式可以分為物理、化學(xué)、航天及其他誘變。

3.1 物理誘變

從上世紀(jì)80年代到目前為止，我國曾有很多學(xué)者探索過60Co－γ射線輻射以及離子注入對煙草植株生長發(fā)育、品質(zhì)、抗氧化酶活性、生理特性、鉀含量以及種子活力、發(fā)芽率等的影響，誘變后大都對煙草植株或種子不利。但也篩選出一些優(yōu)異的材料，殷鳳生等［24］利用氮離子注入處理G 80干種子，經(jīng)連續(xù)選擇鑒定，選育出一個性狀穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)抗病的新品系。王萬軍等［25］利用60Co－γ射線輻射8611、K 326、NC 89花蕾，分別在NC 89、8611突變體中篩選到抗CMV植株各2株、1株，并結(jié)合花藥離體培養(yǎng)的方式獲得了抗CMV種質(zhì)。

3.2 化學(xué)誘變

化學(xué)誘變利用率比較高的試劑是甲基磺酸乙酯（EMS），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所自2008年主持國家局煙草突變體創(chuàng)制項目以來，已經(jīng)從中煙100 EMS誘變4、5代材料中篩選出部分抗病性、抗逆性、耐低鉀、高香氣等不同類型的具有育種價值的材料，并正在進一步鑒定利用［26］。其他的化學(xué)誘變劑有致病病原菌［27－29］及其毒素［30，31］、氨基酸及其類似物［32］、抗菌素［33］等，將他們作為選擇壓誘導(dǎo)愈傷組織、花藥或細(xì)胞懸浮液產(chǎn)生突變體。

3.3 航天誘變

航天誘變具有變異頻率高、幅度大，可以達到地球上無法實現(xiàn)的誘變效果等優(yōu)點。經(jīng)過航天誘變后煙株的生物學(xué)性狀和農(nóng)藝性狀均會發(fā)生不同程度的正負(fù)向變異［34，35］；種子誘變后的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均低于對照［36］，而且隨貯藏時間增加，下降的趨勢高于對照［37］；煙株誘變后的SOD、POD、CAT和ASA活性都顯著或極顯著高于對照［36］。2002年，貴州省煙草科學(xué)研究所利用神舟3號搭載了13個烤煙品種，并從K 326、春雷3號、GT 11和 K 346等推廣品種中鑒定獲得了一批多腋芽矮化［38］、高抗壞血酸［39］和皺葉晚育［40］等變異材料。2005年，云南煙草研究院和河南省農(nóng)科院煙草研究所通過神州6號飛船搭載了一些煙草種子。2004年和2006年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所分別搭載9份和10份材料，并鑒定篩選到誘變紅大、翠碧一號、G 80、NC 89等5、6 代的抗病材料，目前在進一步觀察。

3.4 其他突變

其他類型的突變主要包括無性系變異［41］和T－DNA激活標(biāo)簽插入突變。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所主持的國家局煙草突變體創(chuàng)制項目，利用T－DNA激活標(biāo)簽插入的方式創(chuàng)制突變體，篩選到了抗病、多腋芽、葉皺、白莖、不育、矮化等眾多新材料，并對部分性狀進行了遺傳分析和基因定位克隆。

4 基因工程

轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅是一種基礎(chǔ)研究的手段，在定向改良品種性狀方面，更具有見效快、目標(biāo)明確、效率高等優(yōu)點。但轉(zhuǎn)基因材料的應(yīng)用還存在諸多問題，目前主要作為一種戰(zhàn)略性的熱點研究工具。我國在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高煙草抗蟲性、抗病性、抗逆性、品質(zhì)等方面做了大量的研究。

4.1 轉(zhuǎn)抗病基因

培育抗病轉(zhuǎn)基因煙草的第一種途徑為：將來源于病菌或植物中的抗病基因或抗病生理調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因?qū)氲綗煵葜衼硖岣咂淇共⌒?。例如：將大豆?xì)菌性斑點病菌Psg 12菌株的hrpZPsg12基因?qū)霟煵菰茻?7，獲得了高抗TMV和PVY及中抗煙草野火病菌的植株［42］；將菜豆幾丁質(zhì)酶基因Bchi轉(zhuǎn)入煙草顯著提高了其對真菌病害的抗性［43］；將小麥TaPIM1基因轉(zhuǎn)入煙草，顯著提高了其對青枯病的抗性［44］。第二種途徑為：針對煙草病毒病，通過轉(zhuǎn)病毒外殼蛋白基因（CP）、運動蛋白基因（MP）、復(fù)制酶基因（Rep）的方式或者病毒RNA介導(dǎo)的方式等獲得抗病毒病轉(zhuǎn)基因材料。例如：將PVX和PVY的病毒CP基因轉(zhuǎn)入NC 89，獲得了抗兩種病的材料［45］；通過RNA介導(dǎo)的病毒CP基因，獲得了穩(wěn)定的多抗TMV、CMV和PVY轉(zhuǎn)基因 NC 89［46］；應(yīng)用 RNAi技術(shù)沉默掉 TMV CP 基因，獲得 TMV 免疫的材料 K 326和龍江911［47］；應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默TMV MP基因和CMVRep基因，獲得同時抗TMV和CMV的轉(zhuǎn)基因 K 326［48］。

4.2 轉(zhuǎn)抗蟲基因

目前報道的抗蟲基因主要有Bt內(nèi)毒素基因、植物凝集素基因和蛋白酶抑制劑基因等。練云等［49］將人工改造的Bt基因cry1Ac和cry1Ie分別單獨和同時導(dǎo)入到煙草中，發(fā)現(xiàn)2種Bt基因在煙草中能協(xié)同作用，提高了煙草對野生型棉鈴蟲和Cry 1Ac棉鈴蟲的抗性；轉(zhuǎn)蠟梅凝集素基因煙草具有明顯的抗蚜蟲和抗蛞蝓活性［50］；轉(zhuǎn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因CaCPI的煙草，在接蟲5d后植株上的蚜蟲累積死亡率約90.75%［51］；轉(zhuǎn) 蘇 云 金 芽 胞 桿 菌 中 的 抗 蟲 基 因cry2Ab4和vip3Aa11煙草，顯著提高其對小地老虎的抗性［52］。

4.3 轉(zhuǎn)抗逆基因

抗逆主要分抗寒、抗旱、耐鹽和耐重金屬等?？鼓婊騺碓粗饕菨B透調(diào)節(jié)相關(guān)基因（脯氨酸、果聚糖等）、抗氧化防御體系相關(guān)基因（SOD、CAT、APX基因等）、調(diào)控蛋白相關(guān)基因（轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因等）和膜結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)基因等。果聚糖合成酶基因6－SFT的轉(zhuǎn)基因煙草W 38對干旱和寒冷脅迫具有較強抗性［53］；轉(zhuǎn)胡楊木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶／水解酶基因PeXTH，能夠提高煙草抗旱性［54］；轉(zhuǎn)抗氧化酶基因2－Cys Prx能夠有效減輕煙草對鹽和高光脅迫引起的PSII光抑制［55］；過量表達脯氨酸能夠增強煙草細(xì)胞對毒性重金屬鎘的抗性［56］；過量表達荷花液泡膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因NnNHX1能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性［57］。

4.4 轉(zhuǎn)品質(zhì)相關(guān)基因

目前煙草品質(zhì)基因研究較多的有鉀含量、光合作用、氮代謝和次生代謝等相關(guān)基因。譚穎等［58］將鉀轉(zhuǎn)運體蛋白基因HAK1和煙草TMV抗性蛋白基因CN的pSH－TH共同轉(zhuǎn)入煙草，并篩選無選擇標(biāo)記的植株，獲得的安全轉(zhuǎn)基因株系可作為高鉀親本材料供育種利用；陽春砂1－去氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構(gòu)酶基因DXR超表達轉(zhuǎn)基因煙草的DXR活性及光合色素含量均得到提高［59］；苧麻谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因轉(zhuǎn)基因煙草的生物產(chǎn)量和氮利用效率均得到提高［60］；擬南芥AtPAP1的轉(zhuǎn)基因煙草中花青素含量明顯提高［61］；沉默煙草中編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因NtAN9，導(dǎo)致花青素苷的積累受阻，含量大幅降低，花色由粉紅變?yōu)榘咨?2］。

4.5 轉(zhuǎn)早花基因

常愛霞等［63］利用轉(zhuǎn)擬南芥早花基因FT的材料，結(jié)合TMV抗性基因N分子標(biāo)記篩選的方式，快速回交改良中煙100的TMV抗性，一年多時間就能回交加代到BC4F1，比常規(guī)回交育種時間縮短450～500d，并最終篩選獲得了不含有轉(zhuǎn)基因元件，不含F(xiàn)T基因的材料。該方法為煙草種質(zhì)資源創(chuàng)新開辟了一條捷徑。

5 分子標(biāo)記技術(shù)

分子標(biāo)記技術(shù)是數(shù)量性狀基因研究的主要手段，目前煙草中應(yīng)用最為廣泛的分子標(biāo)記主要是SSR與SNP。我國在煙草抗病、產(chǎn)量、品質(zhì)等關(guān)鍵基因定位和關(guān)聯(lián)分析方面取得了重要進展，同時，也利用分子標(biāo)記輔助育種的方式成功培育出抗黑脛病的紅花大金元以及抗病毒病的K 326。

5.1 抗病相關(guān)標(biāo)記

文軻等［64］以CMV抗病品種臺煙8號、感病品種NC 82為親本，構(gòu)建288株BC1分離群體，并用篩選得到的6 2對多態(tài)性引物定位到1 0號連鎖群上的SSR標(biāo)記53735與抗病QTL緊密連鎖，遺傳距離為0.1cM，貢 獻 率 為 13%。 徐 石 劍 等［65］以 TI 245 為TMV抗病親本、K 326為感病親本，構(gòu)建160株F2群體，并利用166對SSR多態(tài)引物定位到QTL位點與標(biāo)記 TP 217200，遺傳距離為3.3cM，并發(fā)現(xiàn) TI 245是由一對隱性基因控制，與前人研究結(jié)果由兩對隱性基因控制不一致。高玉龍等［66，67］以N 基因主導(dǎo)TMV抗性的Coker 176為抗病親本，以K 326為感病親本，定位到N 2標(biāo)記與QTL遺傳距離為4.3cM，并驗證N 2標(biāo)記可用于N基因控制TMV抗性的分子標(biāo)記輔助選擇育種。王貴等［68］利用抗PVY品種RY 5和感病品種Coker 176構(gòu)建F2群體，篩選到Va基因主導(dǎo)的PVY抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記O 12V3695，遺傳距離為2.1cM。劉勇等［69］利用番茄和辣椒中eIF 4E家族基因保守序列，設(shè)計特異標(biāo)記，定位到標(biāo)記CF 2GR 11與煙草PVY抗病基因Va的遺傳距離為0.99cM。蔣彩虹等［70］以抗赤星病品種凈葉黃和感病品種NC 82為親本，定位到一個緊密連鎖的SSR標(biāo)記，遺傳距離為4cM。Tong et al［71］以抗赤星病品種凈葉黃與感病品種長脖黃構(gòu)建F2群體，利用SSR標(biāo)記共定位到3個QTLs，抗性增效基因均來自抗源凈葉黃。高亭亭等［72］利用抗黑脛病品種 Beinhart 1000－1和感病品種小黃金1025構(gòu)建了220個F2分離群體，定位到5個與煙草黑脛病抗性緊密相關(guān)的 QTLs。Xiao et al［73］利用黑脛病抗源Florida 301和Hicks構(gòu)建重組自交系，定位到11個QTLs，其中位于7號連鎖群上的主效QTL與來源于抗源Beinhart 1000－1的主效位點位置一致。童治軍等［74，75］定位到Ph基因控制黑脛病抗性的緊密連鎖標(biāo)記 TM 29、TM 50、Scf 30K、TM 62、ST 141和InDel 0617可用于分子標(biāo)記輔助育種。牟建英等［76］以抗白粉病品種臺煙7號，感病品種NC 89為親本，構(gòu)建285個單株的F2群體，定位到SSR標(biāo)記52725與QTL緊密連鎖，遺傳距離為1.01cM。楊柳等［77］利用青枯病抗源巖煙97與紅花大金元組合的F2∶3家系，在煙草17號連鎖群上定位到2個主效QTLs和4個具有上位性的微效 QTLs。Qian et al［78］利用Enshu×TI 448A以及巖煙97×TI 448A 兩個組合構(gòu)建了F2∶3和F2∶4群體，并在不同環(huán)境條件下定位到4個青枯病QTLs，且在兩個群體中，都可以重復(fù)定位到連鎖的兩個標(biāo)記PT 20275和PT 30229。楊友才等［79］利用高感青枯病品種紅花大金元與高抗品種TI 448A，證實了RAPD標(biāo)記S 503與煙草青枯病抗性基因連鎖，遺傳距離6.261cM。高加明等［80］對kokubu和膠南香料煙雜交組合進行了分析，篩選出一個源于kokubu的抗青枯病標(biāo)記2303，遺傳距離8.73 cM。吳超等［81］以78份煙草種質(zhì)為自然群體，關(guān)聯(lián)分析得到6個MFLP標(biāo)記與煙草青枯病抗性顯著相關(guān)。詳細(xì)信息見表1。

5.2 品質(zhì)與產(chǎn)量性狀相關(guān)標(biāo)記

肖炳光等［82］以 G 28和 NC 2326為親本材料，構(gòu)建了137個株系的烤煙DH群體，利用4個環(huán)境下的試驗數(shù)據(jù)，進行了總糖、煙堿和氧化鉀3種煙葉化學(xué)成分的QTL初步分析，共檢測到7個加性效應(yīng)QTLs和9對加加上位性效應(yīng)QTLs。李華麗等［83］以烤煙臺煙7號與白肋煙白肋21為雜交親本，構(gòu)建了127個F2和F2∶3家系群體，對煙葉煙堿、總氯、總鉀、葉長、莖葉夾角等重要性狀進行QTL定位，檢測到2個煙堿相關(guān)QTLs、2個總氯相關(guān)QTLs、1個總鉀相關(guān)QTL、4個葉長相關(guān)QTLs和1個莖葉夾角相關(guān)QTL。童治軍等［84］以紅花大金元和Hicks雜交構(gòu)建了207個DH家系，共檢測到與煙葉株高、莖圍、節(jié)距、葉片數(shù)、最大腰葉長和最大腰葉寬6個重要性狀相關(guān)的69個QTLs。譚效磊等［85］利用易烤性好的烤煙品種云煙85和易烤性差的烤煙品種大白筋599雜交所得到的F2群體，共檢測到與易烤性相關(guān)的4個QTLs。余義文等［86］利用24份煙草種質(zhì)，對亞硝胺含量進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)1個SSR位點和6個MFLP位點至少與1種TSNA含量極顯著關(guān)聯(lián)。張吉順等［87］以258份國內(nèi)外烤煙品種為自然群體，在2個環(huán)境下調(diào)查了13個農(nóng)藝性狀，共檢測到18個SRAP標(biāo)記與6個農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)。王國平等［88］對不同生態(tài)區(qū)60份烤煙種質(zhì)的76種致香物質(zhì)含量進行了關(guān)聯(lián)分析，共檢測到5個SSR標(biāo)記與6個致香物質(zhì)同時在2個生態(tài)區(qū)極顯著關(guān)聯(lián)。

表1 抗病QTL定位及連鎖標(biāo)記信息

6 展 望

6.1 加強種質(zhì)資源收集、引進與鑒定

種質(zhì)本身特征特性是種質(zhì)資源創(chuàng)新的根本，決定著種質(zhì)創(chuàng)新的成功與失敗。我國現(xiàn)有保存的種質(zhì)資源數(shù)量位居世界第一，但在遺傳多樣性、特色、稀有種質(zhì)方面還存在不足。因此，需要加大對種質(zhì)資源的收集、引進和鑒定。

1）對全國范圍內(nèi)各個地方考察調(diào)研或聯(lián)合各地方煙草單位收集匯總，發(fā)掘未知種質(zhì)。

2）加強國外種質(zhì)資源的引進，目前國外引進種質(zhì)數(shù)量只占我國總保存數(shù)的15.17%，但在利用次數(shù)最多的27份種質(zhì)中，國外資源的利用率卻達到66.52%［5］，可見國外的資源具有很多我國不具備的優(yōu)異基因，對我國煙草發(fā)展起著重要作用。此外，我國不是煙草的發(fā)源地，野生資源相對較少，而野生種在長期的自然進化中，蘊藏著許多抗病、抗蟲、抗逆、優(yōu)質(zhì)等稀有基因，加強對野生資源的引進利用對于創(chuàng)新突破性種質(zhì)尤為重要。

3）在種質(zhì)資源鑒定方面，美國對保存的烤煙和野生資源進行了比較系統(tǒng)的抗病、抗逆、農(nóng)藝、品質(zhì)等鑒定，大大提高了育種親本選擇的針對性和預(yù)見性。我國雖然取得了一些成效［89，90］，但還存在不系統(tǒng)、不完整、不深入的情況，導(dǎo)致可利用種質(zhì)數(shù)量有限，品種遺傳背景日趨狹窄，種質(zhì)鑒定工作仍需進一步加強，特別是在滿足我國煙草農(nóng)業(yè)和中式卷煙需求的抗病、高香氣、特色香型等性狀方面。

6.2 加強種質(zhì)資源創(chuàng)新理論研究

創(chuàng)新突破性種質(zhì)還需要基礎(chǔ)研究的支撐，特別是在遠緣雜交、細(xì)胞工程、轉(zhuǎn)基因和分子標(biāo)記技術(shù)方面。國外很早就利用細(xì)胞工程和遠緣雜交的方式將一些抗病基因?qū)肓嗽耘酂煵葜?，現(xiàn)有部分煙草品種的黑脛病抗性基因來源于野生煙N.Plumbaginifolia和N.longiflora，并由N.Plumbaginifolia先后育成抗黑脛病品種 NC 2326、NC 567，由 N.longiflora 育成McNair 30、NC 60、K 394等；TMV 抗性基因來源于N.glutinosa，先后育成 Va 770、Coker 86等；根黑腐病抗性基因來源于N.debneyi，先后育成MD 10等系列品種。在分子育種方面，國外對黑脛病抗性基因Ph［91］、TMV 抗性 基 因 N［92］、PVY 抗 性 基 因Va［93］、根結(jié)線蟲抗性基因Rk［94］、根黑腐病抗性基因［95］等都開發(fā)了相應(yīng)的的分子標(biāo)記，并應(yīng)用于育種實踐。近年來，我國在關(guān)鍵基因定位挖掘方面取得了較大成就，并逐步趕上甚至超越國外相關(guān)研究。但仍要加大基礎(chǔ)研究力度，充分將基因組學(xué)、分子生物學(xué)的最新研究成果與種質(zhì)創(chuàng)新有機結(jié)合，利用最新的基因編輯技術(shù)改良創(chuàng)新優(yōu)良種質(zhì)，同時利用最新的分子標(biāo)記開展高通量標(biāo)記檢測以及關(guān)鍵基因定位和克隆，為種質(zhì)創(chuàng)新和分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

［1］羅成剛，楊愛國，常愛霞，等.遺傳育種技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢［R］.煙草科學(xué)與技術(shù)學(xué)科發(fā)展研究，2012.

［2］王獻生，張忠鋒，肖炳光.中國煙草育種研究進展［J］.煙草科技，2007（5）：53－57.

［3］王元英，周健.中美主要煙草品種親源分析與煙草育種［J］.中國煙草學(xué)報，1995，2（3）：11－21.

［4］常愛霞，賈興華，馮全福，等.我國主要烤煙品種的親源系譜分析及育種工作建議［J］.中國煙草科學(xué)，2013，3（4）：1－6.

［5］張興偉，馮全福，楊愛國，等.中國煙草種質(zhì)資源分發(fā)利用情況分析［J］.植物遺傳資源學(xué)報，2016，17（3）：507－516.

［6］楊志曉，王軼，劉紅峰，等.我國主栽烤煙品種親緣關(guān)系及育種［J］.中國煙草學(xué)報，2013，19（2）：34－41.

［7］顏合洪，陳燦，金小馬，等.紅花煙草雜交和自交結(jié)實率的觀察［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，24（6）：442－444.

［8］邢淑華，謝 勝 利，姜 茱.N.stocktonii 和 N.nesophila 抗 黑 脛病能力可用性研究［J］.實驗與調(diào)查，1988，4（2）：4－8.

［9］黨江波，趙申清玉，鄧紅紅，等.Nicotiana tabacumLin.－N.plumbaginifolia Viv.雜種的鑒定及其育性和黑脛病抗性的初步分析［J］.中國煙草學(xué)報，2015，256：93－99.

［10］廖菊夠，康洪梅，朱楠，等.黃花煙草（Nicotiana rustica）、迪勃 納 氏 煙 草 （Nicotiana debneyi）與 Nicotiana tabacum K 326互交親和性的熒光鑒定［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，23（1）：53－59.

［11］朱楠.栽培煙草K 326與五種野生煙草雜交親和性研究［D］.西南大學(xué)生命科學(xué)系，2015.

［12］姚恒，鄭昀曄，索文龍，等.煙草種間雜交親和性［J］.植物分類與資源學(xué)報，2012，34（5）：459－465.

［13］魏治中，閆新甫，鄧志峰，等.煙草與曼陀羅屬間雜交育種研究［J］.中國煙草科學(xué)，2005（1）：1－5.

［14］楊進文，魏治中.煙草與羅勒科間遠緣雜交育種的研究［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，34（1）：10－16.

［15］魏克強，宋欣，楊俊仙，等.煙草與白花曼陀羅屬間遠緣雜種后代化學(xué)成分的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20：778－781.

［16］劉寶，邢苗，張忠恒，等.煙草和枸杞屬間原生質(zhì)體電融合再生雜種植株［J］.植物學(xué)報，1995，37（4）：259－266.

［17］龔明良，卜鍋章，丁昌敏，等.煙草原生質(zhì)體融合選育新品種進展［C］.農(nóng)業(yè)科學(xué)集刊（第二集），北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995：13－19.

［18］吳伯驥，崔亞亞，陳毅平.人工促使煙草和菠菜胚性細(xì)胞間染色質(zhì)穿壁實現(xiàn)植株再生——一項新的細(xì)胞工程技術(shù)（LB技術(shù)）［J］.中國科學(xué)（B輯），1987（10）：1 068－1 073.

［19］夏鎮(zhèn)澳，宛新杉，王輔德，等.煙草與龍葵細(xì)胞雜交和新品系694－L選育的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1993，26（5）：45－50.

［20］宛新杉，王輔德，王光遠，等.從煙草與龍葵細(xì)胞雜交獲得雜種植株［J］.實驗生物學(xué)報，1988，21（2）：245－249.

［21］黃文川.煙草種間體細(xì)胞雜交高代材料的性狀鑒定［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2001，17（2）：33－42.

［22］卜鍋章，龔明良，丁昌敏，等.普通煙草與黃花煙草體細(xì)胞雜種選育出新品系［J］.中國煙草，1992（2）：1－5.

［23］孫玉合，丁昌敏，張歷歷，等.煙草種間體細(xì)胞雜交及其在育種上的應(yīng)用［J］.中國煙草科學(xué)，1998（4）：5－8.

［24］殷鳳生，林國平，孫學(xué)永，等.離子注入誘變法選育煙草新品系研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報，1999，13（1）：49－54.

［25］王萬軍，王文芳，曹建軍，等.輻射與花藥培養(yǎng)相結(jié)合篩選煙草抗黃瓜花葉病毒病突變體［J］.核農(nóng)學(xué)報，1999，13（2）：75－80.

［26］劉貫山.煙草基因組計劃進展篇：2.煙草突變體創(chuàng)制、篩選與鑒定［J］.中國煙草科學(xué)，2013，34（2）：113－114.

［27］陳廷俊，史步君，黃麗華，等.在試管中篩選煙草抗黑脛病突變體［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1993，20（2）：151－156.

［28］王曉莉，于海芹，錢君，等.煙草抗赤星病突變體ces 2－1的產(chǎn)生和鑒定［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，24（4）：497－507.

［29］吳中心，姚根懷，張同慶，等.利用雙層培養(yǎng)基篩選煙草抗赤星病突變體［J］.華北農(nóng)學(xué)報，1993，8（增刊）：123－226.

［30］晏娟.煙草抗黑脛病細(xì)胞突變體的篩選［D］.湖南：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［31］何云昆，呂華飛，吳成軍，等.煙草抗野火病細(xì)胞突變體篩選［J］.中國煙草學(xué)報，1995，2（4）：17－20.

［32］羅士韋，何卓培，徐淑平，等.抗4－氧賴氨酸的煙草愈傷組織突變體及其再生植株組織的研究［J］.中國科學(xué)：化學(xué)生物學(xué)農(nóng)學(xué)醫(yī)學(xué)地學(xué)，1982，12（8）：722－726.

［33］黃麗華，賴宇文，陳庭俊.平陽霉素對煙草誘變作用的初探［J］.作物雜志，1998，8（4）：13.

［34］鐘波.航天誘變烤煙品種的農(nóng)藝性狀變異及SRAP分子標(biāo)記鑒定［D］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［35］邵雪蓮.烤煙空間誘變后代的農(nóng)藝性狀變異與基因組多態(tài)性分析［D］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［36］賀鵬.航天誘變烤煙品種的發(fā)芽特性及酶活性變化研究［D］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［37］李佛琳，強繼業(yè)，羅以貴，等.太空飛行對3個烤煙品種種子活力的影響［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，47（9）：1 046－1 050.

［38］鄭少清，胡重怡，葉定勇，等.航天搭載誘變獲得多腋芽矮化遺傳的煙草突變體——T－srd［J］.中國煙草科學(xué)，2011，32（2）：6－10.

［39］鄭少清，葉定勇，楊俊.航天條件對煙草幾個性狀變異的影響［J］.中國煙草科學(xué)，2004，25（1）：1－4.

［40］Cai L T，Zheng S Q，Huang X L.A crinkly leaf and delay flowering mutant of tobacco obtained from recoverable satellite－flown seeds［J］.Space Res.2007，40：1 689－1 693.

［41］黃文川.煙草體細(xì)胞無性系變異及突變體抗病性篩選［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999（6）：55－57.

［42］楊麗娜，劉興娜，盧寶慧，等.hrpZPsg12轉(zhuǎn)基因煙草及其抗性評價［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015（10）：70－76.

［43］王全偉，曲敏，張海玲，等.菜豆幾丁質(zhì)酶基因Bchi的克隆及其在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達［J］.分子植物育種，2008（1）：53－58.

［44］周賢堯，董娜，劉紅霞，等.小麥TaPIM1基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性分析［J］.作物學(xué)報，2010（6）：911－917.

［45］白慶榮，朱俊華，劉曉玲，等.利用RNA介導(dǎo)的抗病性獲得抗2種病毒的轉(zhuǎn)基因煙草［J］.植物病理學(xué)報，2005（2）：148－154.

［46］朱常香，宋云枝，溫孚江.多抗PVY、TMV和CMV轉(zhuǎn)基因煙草的培育［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（4）：1 040－1 047.

［47］顏培強，白先權(quán)，萬秀清，等.應(yīng)用RNAi技術(shù)培育抗TMV病毒轉(zhuǎn)基因煙草［J］.遺傳，2007，29（8）：1 018－1 022.

［48］牛顏冰，王德富，姚敏，等.應(yīng)用RNA沉默技術(shù)獲取抗黃瓜花葉病毒（CMV）和煙草花葉病毒（TMV）轉(zhuǎn)基因煙草［J］.作物學(xué)報，2011（3）：484－488.

［49］練云，賈志偉，何康來，等.人工改造的Cry1Ac和Cry1Ie基因在煙草中共表達對棉鈴蟲有更好的殺蟲活性［J］.科學(xué)通報，2008，53（6）：658－663.

［50］眭順照，李琳莉，祝欽瀧，等.蠟梅凝集素基因克隆及其對蚜蟲、蛞蝓抗性分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（2）：358－368.

［51］王江英，范正琪，殷恒福，等.杜鵑紅山茶CaCPI基因的克隆及過量表達提高煙草植株的抗蟲性［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2015（5）：57－64.

［52］高川，郎志宏，朱莉，等.轉(zhuǎn)cry2Ab4和vip3Aa11基因煙草對小地老虎殺蟲效果研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2012（5）：42－48.

［53］賀曉嵐，王建偉，李文旭，等.大賴草6－SFT基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因煙草抗旱和抗寒性分析［J］.作物學(xué)報，2016（3）：389－398.

［54］韓彥莎，儀慧蘭.過表達胡楊XTH基因能夠提高煙草抗旱性［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2016（8）：919－925.

［55］張會慧，田褀，劉關(guān)君，等.轉(zhuǎn)2－CysPrx基因煙草抗氧化酶和PSII電子傳遞對鹽和光脅迫的響應(yīng)［J］.作物學(xué)報，2013（11）：2 023－2 029.

［56］支立峰，余濤，朱英國，等.過量表達脯氨酸的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞對毒性重金屬的抗性增強［J］.湖北師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2006（2）：14－19.

［57］郭會敏，顧春筍，陳發(fā)棣，等.荷花NnNHX1基因耐鹽性在轉(zhuǎn)化煙草中的驗證［J］.園藝學(xué)報，2012（2）：323－332.

［58］譚穎，秦利軍，趙丹，等.共轉(zhuǎn)化法獲得HAK1基因高表達煙草提高植株鉀吸收能力［J］.植物生理學(xué)報，2013（7）：689－699.

［59］劉卉，楊錦芬，詹若挺，等.陽春砂DXR超表達提高轉(zhuǎn)基因煙草DXR活性及光合色素含量［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012（1）：92－97.

［60］鄭建樹，喻春明，陳平，等.苧麻谷氨酰胺合成酶BnGS 2等位基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因煙草特性［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，17：3 348－3 358.

［61］連文力，張松濤，李艷華，等.AtPAP1基因在煙草中的表達［J］.煙草科技，2016（7）：1－7.

［62］崔超軍，馬坤，李嘉敏，等.NtAN 9基因的RNAi改變轉(zhuǎn)基因煙草花色［J］.重慶師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016（4）：145－149.

［63］常愛霞，郭利杰，劉旦，等.早花基因（FT）介導(dǎo)的煙草快速回交改良研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，13：2 508－2 517.

［64］文軻，張志明，任民，等.烤煙CMV抗性基因QTL定位［J］.中國煙草科學(xué)，2013（3）：55－59.

［65］許石劍，肖炳光，高玉龍，等.煙草Ti 245抗煙草葉病毒的遺傳分析及抗性基因定位［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011（2）：123－126.

［66］高玉龍，肖炳光，童治軍，等.煙草抗TMV基因連鎖分子標(biāo)記的篩選及在抗病資源篩選中的應(yīng)用［J］.分子植物育種，2011（5）：585－591.

［67］高玉龍，肖炳光，盧秀萍，等.分子標(biāo)記檢測N基因控制的煙草 TMV抗性的方法，CN 101892304B［P］.2012.

［68］王勇，劉勇，盧秀萍，等.煙草PVY抗性的遺傳分析與分子標(biāo)記篩選［J］.分子植物育種，2012，10（1）：97－103.

［69］劉勇，王丙武，宋中邦，等.一種鑒定煙草PVY抗性的分子標(biāo)記，CN 103898228B［P］.2016.

［70］蔣彩虹，羅成剛，任民，等.一個與凈葉黃抗赤星病基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記［J］.中國煙草科學(xué)，2012（1）：19－22.

［71］Tong Z，Jiao T，Wang F，et al.Mapping of quantitative trait loci conferring resistance to brown spot in flue－cured tobacco（Nicotiana tabacum L.）［J］.Plant Breed，2012，131：335－339.

［72］高亭亭，蔣彩虹，羅成剛，等.煙草品種 Beinhart1000－1抗黑脛病基因的 QTL定位［J］.植物遺傳資源學(xué)報，2015（2）：330－335.

［73］Xiao B，Drake K，Vontimitta V，et al.Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar‘Florida 301’［J］.Crop Sci，2013，53：473－481.

［74］童治軍，肖炳光，李永平，等.一種用于煙草黑脛病抗性基因Ph輔助選擇的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，CN 103993013A［P］.2014.

［75］童治軍，肖炳光，方敦煌，等.一種抗煙草黑脛病Ph基因連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，CN105506148A［P］.2016.

［76］牟建英，錢玉梅，任民，等.煙草白粉病抗性基因的QTL定位［J］.生物技術(shù)，2013，19（4）：105－108.

［77］楊柳.煙草SSR遺傳圖譜構(gòu)建及青枯病抗性QTL定位［M］.福建，福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

［78］Qian Y L，Wang X S，Wang D Z，et al.The detection of QTLs controlling bacterial wilt resistance in tobacco （N.tabacumL.）［J］.Euphytica，2013，192（2）：259－266.

［79］楊友才，周清明，朱列書.煙草青枯病抗性基因的遺傳分析及 RAPD標(biāo)記［J］.中國煙草學(xué)報，2006，12（2）：38－42.

［80］高加明，王志德，張興偉，等.香料煙青枯病抗性基因的遺傳分析［J］.中國煙草科學(xué)，2010，31（1）：1－4.

［81］吳超，夏巖石，李榮華，等.煙草青枯病抗性與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析［J］.煙草科技，2015（10）：1－12.

［82］肖炳光，盧秀萍，焦芳蟬，等.烤煙幾種化學(xué)成分的QTL初步分析［J］.作物學(xué)報，2008（10）：1 762－1 769.

［83］李華麗，陳美霞，周東新，等.煙草六個重要性狀的QTL定位［J］.作物學(xué)報，2011（9）：1 577－1 584.

［84］Tong Z J，Jiao F C，Wu X F，et al.Mapping of quantitative trait loci underlying six agronomic traits in flue－cured tobacco（Nicotiana tabacumL.）［J］.Acta Agronomica Sinica，2012，38（8）：1 407－1 415.

［85］譚效磊，徐秀紅，王暖春，等.烤煙易烤性QTL定位分析［J］.分子植物育種，2012（2）：201－206.

［86］余義文，夏巖石，李榮華，等.煙草種質(zhì)材料TSNA含量的關(guān)聯(lián)分析［J］.中國煙草學(xué)報，2014（3）：48－55.

［87］張吉順，王仁剛，楊春元，等.國內(nèi)外烤煙品種農(nóng)藝性狀的遺傳多樣性及與SRAP標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析［J］.作物學(xué)報，2012（6）：1 029－1 041.

［88］王國平，李艷麗，羅成剛，等.烤煙SSR標(biāo)記多樣性及與致香物質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析［J］.植物遺傳資源學(xué)報，2016（4）：671－682.

［89］代帥帥，任民，蔣彩虹，等.煙草骨干親本主要病毒病抗性鑒定及遺傳多樣性分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（6）：1 228－1 239.

［90］黃元炯，張生杰，馬永建，等.不同烤煙品種（基因型）氮效率及耐低氮能力的差異［J］.煙草科技，2013（4）：71－77.

［91］Jonhson E S，Wolff M F，Wernsman E A，et al.Marker－assisted selection f or resistance to black shank disease intobacco［J］.Plant Disease，2002，86（12）：1 303－1 309.

［92］Lewis R S，Milla S R，and Levin J S.Molecular and genetic characterization of Nicotiana glutinosa L.chromosome segments in Tobacco mosaic virus－Resistant tobacco accessions［J］.Crop Sci，2005，45（6）：2 355－2 362.

［93］Tajima T，Noguchi S，Tanoue W，et al.Background selection using DNA markers in backcross breeding program for Potato Virus Y resistance of tobacco［J］.Breeding Science，2002，52：253－257.

［94］Yi H Y，Rufty R C，Wernsman E A，et al.Mapping the root－knot nematode resistence gene（Rk）in tobacco with RAPD makers［J］.Plant Disease，1998，82（12）：1 319－1 322.

［95］Bai D，Reeleder R，and Brandle J E.Identification of two RAPD markers tightly linked with the Nicotiana debneyi for resistance to black root rot of tobacco［J］.Theor Appl Genet，1995，91（8）：1 184－1 189.