貴州糯質(zhì)小麥的分子標(biāo)記輔助育種研究

程 斌， 辛智海， 高 旭， 隋建樞， 曹 寧， 丁延慶， 何慶才， 張立異

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所， 貴陽(yáng)550006； 2.貴州大學(xué)生命科學(xué)院， 貴陽(yáng)550025）

在水稻、玉米和高梁等谷類作物中都存在由自然變異形成的糯性類型，并有糯性品種（系）應(yīng)用于生產(chǎn)。然而，同為谷類作物的普通小麥，迄今為止自然界尚未發(fā)現(xiàn)其糯性類型。1993年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在控制小麥的籽粒直鏈淀粉合成中，有一種酶起著主要作用，這種酶就是顆粒結(jié)合淀粉合成酶（Granule－bound starch synthase I，簡(jiǎn)稱GBSSI），也稱 Waxy蛋白。直鏈淀粉含量較高的小麥存在Waxy蛋白，而直鏈淀粉含量很低的小麥缺少甚至沒有 Waxy蛋白，Waxy蛋白的存在與否決定著谷物的糯性和非糯性，編碼Waxy蛋白的等位基因被命名為Wx基因。普通六倍體小麥（Triticum aestivumL.，AABBDD）含有3種Wx 蛋白亞基：Wx－A 1、Wx－B 1和 Wx－D 1，分別位于染色體7 AS、4AL和7DS上，它們相應(yīng)的表達(dá)型等位基因?yàn)閃x－A1a、Wx－B1a、Wx－D1a，相應(yīng)的缺失型為 Wx－A1b、Wx－B1b、Wx－D1b［1］。任一種蛋白亞基的缺失或失活可導(dǎo)致直鏈淀粉含量降低，一方面可能是更多物質(zhì)參與支鏈淀粉合成，導(dǎo)致直鏈淀粉合成的絕對(duì)量下降；另一方面可能是直鏈淀粉含量下降，支鏈淀粉含量不變，導(dǎo)致直鏈淀粉相對(duì)量的減少。3個(gè)蛋白亞基均存在天然缺失，如日本小麥品種關(guān)東107缺失Wx－A 1和Wx－B 1蛋白亞基，中國(guó)地方品種白火麥缺失 Wx－D 1蛋白亞基，其相應(yīng)基因被分別命名為Wx－A1b、Wx－B1b和Wx－D1b。Nakamura等［2］在關(guān)東107小麥和白火麥雜交后代中選育出了世界上第一個(gè)直鏈淀粉含量在0.6%～0.7%之間的糯小麥。

糯小麥的低直鏈淀粉含量這一特性使其在面條加工業(yè)、淀粉加工業(yè)及其它工業(yè)上有著重要的用途。比如可以提高面條的品質(zhì)；低直鏈淀粉品種穗不易發(fā)芽，避免收獲前的產(chǎn)量損失，還能避免加工中α－淀粉酶活性升高造成的面粉質(zhì)量下降；糯小麥的面粉可以用于配粉，提高面條的品質(zhì)，改善饅頭的白度，延長(zhǎng)速凍食品的貨架壽命；糯小麥還可以用于生產(chǎn)環(huán)保塑料、糯米紙類食品包裝紙、硬紙板、濃縮劑、漿糊、涂料原料、紡織業(yè)的打漿劑等；特別是糯小麥在釀酒方面具有較大利用價(jià)值。趙國(guó)君等研究表明，在酒廠生產(chǎn)條件下，糯小麥白酒有相對(duì)較高的出酒率和雜醇類物質(zhì)含量、適中的酸類和酯類物質(zhì)含量、較低的醛類物質(zhì)含量，糯小麥白酒在氣味和口感方面優(yōu)于其它試驗(yàn)組白酒［3］。貴州是白酒的主產(chǎn)區(qū)，對(duì)釀酒原料需求大，選育出適應(yīng)貴州種植的酒用糯小麥，在改善貴州白酒品質(zhì)的同時(shí)，還可以增加農(nóng)民收益，實(shí)現(xiàn)雙贏的局面。

分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)（Marker Assisted Selection，MAS）是利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記對(duì)作物目標(biāo)性狀進(jìn)行間接選擇，在早代就能夠?qū)δ繕?biāo)基因的轉(zhuǎn)移進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，而且克服隱性基因再度利用時(shí)識(shí)別的困難，從而加速育種進(jìn)程，提高育種效率，選育抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的新品種。MAS技術(shù)在小麥的分子育種中得到了廣泛應(yīng)用。在糯小麥的 MAS中，舒守貴等［4］以中國(guó)春糯性位點(diǎn)全套近等基因系為研究材料，用小麥Wx基因的6個(gè)STS標(biāo)記和1個(gè)CAPS標(biāo)記進(jìn)行了篩選；張晶等［5］對(duì)173份小麥的蛋白質(zhì)亞基進(jìn)行分子標(biāo)記掃描并構(gòu)建了多重 PCR；王亮等［6］利用 Wx－A 1、Wx－B 1和 Wx－D 1位點(diǎn)的3個(gè)STS標(biāo)記對(duì)250份新疆小麥品種Wx基因的組成進(jìn)行了鑒定，同時(shí)測(cè)試了185份冬、春小麥品種的淀粉糊化特性。

為了提高適應(yīng)貴州生產(chǎn)的抗病糯小麥的育種效率，本實(shí)驗(yàn)采用 Wx－B1、Wx－A1、Wx－D1基因的分子標(biāo)記［7－8］，對(duì)本地優(yōu)良品系與糯小麥的雜交后代進(jìn)行Wx基因鑒定與篩選，評(píng)估分子標(biāo)記在糯質(zhì)小麥MAS育種中的應(yīng)用，為加快糯性小麥新品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本實(shí)驗(yàn)采用小麥品系俞糯麥、自育品系0117以及雜交F2代的56個(gè)單株為試驗(yàn)材料。俞糯麥為不攜帶任何3個(gè)Wx基因的全糯質(zhì)小麥材料，由重慶地區(qū)農(nóng)科所提供。自育品系0117是一個(gè)綜合性狀較好并具有良好抗性的完全非糯質(zhì)小麥品系，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所選育并提供。

1.2 Wx基因檢測(cè)標(biāo)記

實(shí)驗(yàn)中使用的3對(duì)Wx基因分子標(biāo)記中，與等位基因Wx－A1a／b和Wx－D1a／b連鎖的標(biāo)記是SSR標(biāo)記，而與Wx－B1a／b連鎖的標(biāo)記是STS標(biāo)記。它們名稱、序列信息及擴(kuò)增片段大小如表1所示。

1.3 DNA提取及PCR分析

親本及群體種子發(fā)芽，幼苗培養(yǎng)至一葉一心，基因組DNA的提取采用CTAB法［9］，略做改動(dòng)，將DNA樣品稀釋到50ng／μL備用。

PCR 擴(kuò)增SSR 引物根據(jù)http：／／www.graingenes.org公布的引物序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。在 MJ Research PTC－200型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系（15μL）：DNA 模板5.0 μL；10×Buffer 2.0μL；MgCl21.2μL；2.5mmol／L dNTP 0.4μL；10mmol／L 引物各0.8μL；2.5U／μL Taq酶0.2μL；ddH2O 4.6μL。

基本反應(yīng)條件：94℃3min；94℃2min，58℃／61℃1min（視引物退火溫度而定），72℃2min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；10℃保存。取3μL擴(kuò)增產(chǎn)物在6%非變性連續(xù)PAGE上恒壓（130～150V），電泳2～2.5h，銀染，凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)觀察、照相?；蛘呷?2.5μL擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖膠上100V，電泳30min，EB染色，凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)觀察、照相。

表1 Wx基因的分子標(biāo)記

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究利用Excel軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和卡方驗(yàn)證分析?？ǚ津?yàn)證是將實(shí)際比數(shù)與理論比數(shù)進(jìn)行比較，以確定二者的符合程度，從而確定某一分離比例是否能用某種遺傳規(guī)律去解釋。計(jì)算公式為：

卡方值（X2）＝（觀測(cè)值－理論值）2／理論值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Wx基因標(biāo)記掃描結(jié)果

自育品系0117是完全非糯質(zhì)小麥，其基因型為Wx－A1a、 Wx－A1a／Wx－B1a、 Wx－B1a／Wx－D1a、Wx－D1a，而俞糯麥?zhǔn)侨促|(zhì)小麥，其基因型Wx－A1b、Wx－A1b／Wx－B1b、Wx－B1b／Wx－D1b、Wx－D1b。利用與3個(gè)糯質(zhì)基因Wx－A1、Wx－B1和Wx－D1緊密連鎖的分子標(biāo)記 Mag 264、BDFL／BRD和 Mag 269掃描2個(gè)親本以及56個(gè)F2代的單株，結(jié)果如圖1所示。

Mag 264為共顯性標(biāo)記（SSR），獲得2個(gè)擴(kuò)增片段分別為336bp和317bp，其中317bp片段與糯質(zhì)等位基因位點(diǎn)Wx－A1b連鎖。56個(gè)F2后代中，10個(gè)單株攜帶非糯質(zhì)的等位基因位點(diǎn)Wx－A1a，基因型為Wax－A1a、Wax－A1a，為非糯質(zhì)小麥；14個(gè)單株攜帶糯質(zhì)的等位基因位點(diǎn)Wax－A1b，基因型為Wax－A1b、Wax－A1b，為糯質(zhì)小麥；其余25個(gè)單株是雜合體，基因型為Wax－A1a、Wax－A1b，為非糯質(zhì)小麥，另外有7個(gè)單株未檢測(cè)到條帶。利用卡方檢驗(yàn)，在顯著水平p＞0.05時(shí)，X2＝0.714，說明該位點(diǎn)在F2代群體分離比符合AA∶Aa∶aa＝1∶2∶1的分離比（圖1，表2）。

BDFL／BR為顯性標(biāo)記（STS），PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)425bp片段，與非糯質(zhì)的等位基因Wx－B1a緊密連鎖。56個(gè)F2后代中，32個(gè)單株攜帶此片段，說明它們的 基因型 為Wx－B1a、Wx－B1a 或Wx－B1a、Wx－B1b，應(yīng)為非糯性小麥；24個(gè)單株沒有此位點(diǎn)，說明其基因型為Wx－B1b、Wx－B1b，為糯性小麥。利用卡方檢驗(yàn)，在p＞0.05時(shí)，X2＝0.002，說明F2代分離比符合（BB＋Bb）∶bb＝3∶1（圖2，表2）。

Mag 269為共顯性標(biāo)記（SSR），但是在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果中卻表現(xiàn)為顯性標(biāo)記，可能是Wx－D1基因3’端大片段缺失的雜合體DNA結(jié)構(gòu)會(huì)影響PCR的擴(kuò)增［8］，PCR 擴(kuò)增獲得2個(gè)片段分別為1 400bp和800bp，其中800bp片段與糯質(zhì)基因Wx－D1b連鎖。56個(gè)F2后代中，22個(gè)單株攜帶非糯質(zhì)的等位基因位點(diǎn)Wx－D1a，為非糯質(zhì)小麥；34個(gè)單株攜帶糯質(zhì)的等位基因位點(diǎn)Wx－D1b。該位點(diǎn)在F2代的分離符合DD∶（Dd＋dd）＝1∶3的分離比（X2＝0.136，p＞0.05）（圖3，表2）。

圖1 標(biāo)記Mag 264在品系0117和俞糯麥的F2代群體部分單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 標(biāo)記BDFL／BR在品系0117和俞糯麥的F2代群體部分單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 標(biāo)記Mag269在品系0117和俞糯麥的F2代群體部分單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

表2 F2后代Wx基因位點(diǎn)掃描結(jié)果

續(xù)表2

2.2 F2代群體中糯質(zhì)小麥出現(xiàn)的頻率

對(duì)3個(gè)標(biāo)記的掃描結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在56個(gè)F2代分離群體中，3個(gè)基因位點(diǎn)都存在的材料有4株（7.14%）；單缺失 Wx－A1a 或 Wx－B1a 或 Wx－D1a基因位點(diǎn)的材料編號(hào)分別為5（8.93%）、8（14.29%）和19（33.93%）；Wx－A1a 和Wx－B1a 基因位點(diǎn)同時(shí)缺失的材料為5株（8.93%）；Wx－A1a 和 Wx－D1a 基因 位點(diǎn) 同 時(shí) 缺 失 的 材 料 為 4 株 （7.14%）；Wx－B1a 和Wx－D1a基因位點(diǎn)同時(shí)缺失材料為11株（19.64%）；3個(gè)基因位點(diǎn)都缺失的全糯質(zhì)單株未發(fā)現(xiàn)。

3 討 論

貴州釀酒的歷史悠久，糯小麥具有良好的釀酒特性，但是貴州省內(nèi)缺乏具有推廣價(jià)值的糯性小麥，省外引進(jìn)的糯質(zhì)小麥品種易感條銹病、白粉病和赤霉病等病害，無(wú)法適應(yīng)貴州的生態(tài)氣候環(huán)境，因此選育綜合性狀優(yōu)良、產(chǎn)量高的糯性小麥新材料擁有巨大市場(chǎng)前景和科研價(jià)值。糯性小麥鑒定方法很多，比如利用半粒種子可以進(jìn)行碘染色檢測(cè)，但只能鑒定糯與非糯，無(wú)法鑒定部分糯小麥類型。改良的Waxy蛋白SDS－PAGE電泳方法雖簡(jiǎn)化了步驟，降低了成本，但Wx－B1和Wx－D1遷移率非常接近，仍難以區(qū)分，且該方法需要破壞種子，在大量篩選和分離后代檢測(cè)中的應(yīng)用也受到限制。Wx－A1b、Wx－B1b和Wx－D1b都是隱性基因，利用傳統(tǒng)育種通常需要較長(zhǎng)的育種年限；并且當(dāng)只有1～2個(gè)隱性基因存在時(shí)，即使純合體也很難根據(jù)表型對(duì)其進(jìn)行直接選擇。因此，分子標(biāo)記輔助選擇是培育不同支鏈淀粉含量小麥品種的最有效方法。

近年來，根據(jù)Wx基因的已知序列，相繼開發(fā)出了3個(gè)位點(diǎn)的分子標(biāo)記［7－11］和這些分子標(biāo)記在基因型鑒定中具有快速、準(zhǔn)確和簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)點(diǎn)，在植株整個(gè)發(fā)育時(shí)期和任何部位均可取材檢測(cè)。段軍［12］利用糯質(zhì)基因分子標(biāo)記鑒定出12個(gè)株系的全糯藍(lán)粒小麥；馬紅勃［13］以揚(yáng)麥17（紅皮）和揚(yáng)麥01－2（白皮）2個(gè)背景的wx基因近等基因系，對(duì)不同遺傳背景和栽培環(huán)境下材料的品質(zhì)特性進(jìn)行了研究；許立奎等［14］利用多重PCR技術(shù)鑒定F2代群體內(nèi)的糯質(zhì)基因；楊芳萍等［15］利用糯質(zhì)基因分子標(biāo)記對(duì)甘肅小麥糯質(zhì)蛋白分布進(jìn)行研究，結(jié)果表明Wx－B1b基因從西向東南部逐漸降低；普布卓瑪［16］通過雜交、回交以及自交等方法將3個(gè)糯蛋白缺失基因聚合在一個(gè)小麥遺傳背景中。

本研究利用糯質(zhì)基因特異分子標(biāo)記，在F2代分離群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)單個(gè)缺失Wx基因材料的數(shù)目依次為Wx－D1a最 多、Wx－B1a 其 次、Wx－A1a 最 少，但 是 未能發(fā)現(xiàn)同時(shí)缺失3個(gè)Wx基因的全糯質(zhì)小麥株系，這應(yīng)該與分離群體較小有關(guān)。根據(jù)孟德爾分離定律，位于不同染色體上3個(gè)等位基因（Aa／Bb／Dd）的分離情況中，3個(gè)隱形等位基因同時(shí)出現(xiàn)的頻率為1.56%（1／64）。由于F2代分離群體只有56個(gè)，3個(gè)隱形基因同時(shí)出現(xiàn)的理論值應(yīng)該等于0.875，所以在群體中沒有檢測(cè)到同時(shí)缺失3個(gè)Wx基因的株系也屬正常。理論上1 000個(gè)F2代群體只能獲得16株全糯小麥，如果還需要考慮抗病和高產(chǎn)等其他性狀，F(xiàn)2代群體還需要進(jìn)一步增加。因此，為了選育具有較好綜合性狀的抗病全糯質(zhì)小麥，需要擴(kuò)大候選群體大?。ǎ? 000），或者利用部分糯性小麥品系間的雜交，比如F2代群體內(nèi)單缺失wx－A1a的5個(gè)單株與缺失wx－B1a＋wx－D1a的11個(gè)單株雜家，再利用回交、聚合雜交等方法提高全糯質(zhì)小麥的選育效率。

4 結(jié) 論

本次實(shí)驗(yàn)采用自育品系0117和俞糯麥作為親本，對(duì)他們的雜交后代利用Wx基因分子標(biāo)記篩選糯質(zhì)小麥。在顯著水平p＞0.05時(shí)，3個(gè)糯質(zhì)基因在F2代中的分離比例符合預(yù)期比例，并檢出了不同Wx基因組合的小麥單株，但是未能檢測(cè)出3個(gè)基因都缺失的全糯質(zhì)小麥單株。本研究結(jié)果表明，在生產(chǎn)實(shí)踐中利用標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)的育種經(jīng)驗(yàn)，可以加快貴州省高產(chǎn)、糯質(zhì)小麥的創(chuàng)新及應(yīng)用。

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