大果沙棗活性成分的提取及體外抑菌活性研究

岳惠惠，美合熱阿依·木臺(tái)力甫

(喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院/葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆喀什 844006)

大果沙棗具有抗旱、抗風(fēng)沙、耐貧瘠、耐鹽堿等特點(diǎn)[1-3]。沙棗果富含多種保健成分[4]，多用于治療消化不良、脾胃虛弱等疾病[5]，但目前這一寶貴資源的利用率極低[6]，僅有極少部分的沙棗果被食用、藥用或初步加工[7]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其化學(xué)成分和藥理作用研究表明，沙棗中的多糖對(duì)呼吸道的合胞病毒具有一定的抑制作用，鞣質(zhì)具有抗炎的作用[8]，黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化和降低血清膽固醇等功效[9]，故沙棗是西北地區(qū)具有開(kāi)發(fā)利用前景的重要資源。

有關(guān)沙棗中單一成分的定量分析研究及其單一成分的抑菌作用較多[10]，但是有關(guān)南疆地區(qū)大果沙棗果皮、果肉、種子活性成分的定性分析及其體外抑菌活性的研究較少。大果沙棗在喀什、和田、阿克蘇廣為栽培，本研究結(jié)合南疆喀什地區(qū)沙棗資源豐富的優(yōu)勢(shì)，利用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)大果沙棗果皮、果肉、種子的活性成分進(jìn)行定性分析檢測(cè)，分別對(duì)3種原料的活性成分提取液在體外的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，為沙棗的綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1儀器與試劑 材料：大果沙棗，產(chǎn)于新疆喀什。儀器：202型電熱恒溫干燥箱；FA2204N電子天平；DG-160型藥材粉碎機(jī)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；GH-400型隔水式培養(yǎng)箱；空氣浴恒溫?fù)u床。試劑：無(wú)水乙醇、95%乙醇、丙酮、濃硫酸、

氫氧化鈉、硫酸銅、蘇丹Ⅲ干粉、水合茚三酮、氯化鋁、氯化鐵、溴酚藍(lán)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉(均為分析純)。

1.1.2指示菌 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌4種指示菌等均由喀什大學(xué)葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(用于活化菌種)和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)指示菌)。

1.2 試驗(yàn)方法

將大果沙棗分離成果皮、果肉、種子為原料，采用索氏抽提法提取3種原料，再定性分析檢測(cè)部分活性成分，最后采用抑菌圈法研究大果沙棗果皮、果肉、種子的活性成分提取液對(duì)4種指示菌抑菌活性的影響。

1.2.1活性成分提取 取一定量經(jīng)過(guò)預(yù)處理的果皮、果肉、種子3種原料，在電熱恒溫干燥箱中95～105℃烘烤2 h，快速測(cè)出3種原料的含水率，在粉碎機(jī)內(nèi)將原料粉碎，80目過(guò)篩后，將3種粉末再烘至恒重[11]。準(zhǔn)確稱(chēng)取果肉粉末10g，加入1∶10料液比的95%乙醇，80℃加熱索氏抽提法提取8h后，將提取瓶里的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮使最終質(zhì)量濃度為1g/mL，置于冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2活性成分提取液的定性分析檢測(cè) 將最終質(zhì)量濃度為1g/mL的3種提取液用活性炭除去色素，對(duì)各提取液進(jìn)行部分化學(xué)成分的定性分析檢測(cè)[12-13]，觀察現(xiàn)象的變化(表1)。

表1 各原料提取液中活性成分定性分析檢測(cè)步驟

1.2.3沙棗果的活性成分提取液在體外抑菌活性的測(cè)定

(1)提取液的制備 分別取3種原料最終質(zhì)量濃度為1g/mL的備用提取液各5mL。(2)菌懸液的制備 用接種環(huán)挑取3～4環(huán)培養(yǎng)24h的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌分別置于100mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在空氣浴恒溫?fù)u床37℃下180r/min培養(yǎng)48 h，制成一定菌體濃度的菌懸液[14]，備用。(3)抑菌效果的測(cè)定 用打孔器將厚度為1.5mm的定量濾紙制成6mm直徑的圓紙片，121℃干燥滅菌20min，分別放入果皮提取液的濃縮液、果肉提取液的濃縮液、種子提取液的濃縮液、無(wú)菌水和95%的乙醇中浸泡2 h[15-16]。在超凈工作臺(tái)上用移液器分別吸取4種菌懸液100μL，用涂布棒將菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上制成含菌平板，再用無(wú)菌鑷子將濾紙片貼在含菌培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于培養(yǎng)皿表面，蓋好培養(yǎng)皿[17]。以浸有無(wú)菌水和95%乙醇的濾紙片作為對(duì)照，每個(gè)含菌平板中等距放4片(圖1)，4種指示菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽包桿菌、普通變形桿菌)，每種菌做4個(gè)平行試驗(yàn)。

圖1 濾紙片在固體培養(yǎng)基的放置位置注：A：果皮提取液；B：果肉提取液；C：種子提取液；D：無(wú)菌水E：95%乙醇

待濾紙片牢固緊貼于培養(yǎng)基以后，將含菌培養(yǎng)基倒置在恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h，然后采用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑[18-20]，重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值作為抑菌圈大小的最終結(jié)果。設(shè)95%乙醇為對(duì)照，用式(1)計(jì)算相對(duì)抑制率[21]：

(1)

式(1)中，對(duì)照菌落的抑菌圈直徑為95%乙醇的抑菌圈直徑；各菌落的抑菌圈直徑=抑菌圈平均直徑-濾紙片直徑

2 結(jié)果與討論

2.1 活性成分的提取和檢測(cè)

大果沙棗果皮采用索氏抽提法提取8 h后，提取瓶中的液體呈橘紅色、透明、無(wú)沉淀、略甜散發(fā)有沙棗花的香氣；果肉提取8 h后，提取瓶的液體呈橘紅色、有白色絮狀沉淀、并有球狀脂肪顆粒析出、香氣甜膩；種子經(jīng)過(guò)提取8 h后，提取瓶的液體呈淡淡的橘色、有白色晶體析出、略甜、幾乎無(wú)香氣；3種提取液冷卻至室溫以后均變渾濁，均有白色顆粒析出(表2)。

表2 各原料的含水率

相同質(zhì)量的3種原料干粉，提取濃縮為1g/mL的溶液，進(jìn)行部分活性成分的定性分析檢測(cè)，由表3可知，檢測(cè)多糖時(shí)，大果沙棗果皮提取液和果肉提取液的顯色反應(yīng)較明顯，種子次之；檢測(cè)氨基酸時(shí)，果肉提取液的紫色最深，種子和果皮次之；脂肪顯色反應(yīng)的深淺順序依次為果肉提取液、種子提取液、果皮提取液，種子中除了木質(zhì)素和纖維素就是果仁，果仁種含有脂肪；定性檢測(cè)有機(jī)酸時(shí)，果皮提取液中的斑點(diǎn)數(shù)量均大于果肉和種子；檢測(cè)黃酮時(shí)，種子提取液的絡(luò)合物最多，果皮和果肉次之。綜上，在同等質(zhì)量下的果皮、果肉和種子經(jīng)過(guò)提取濃縮為1g/mL后，經(jīng)過(guò)定性檢測(cè)，果皮提取液中的有機(jī)酸、黃酮和多糖的相對(duì)反應(yīng)較明顯；果肉提取液中的氨基酸、脂肪、有機(jī)酸、多糖的反應(yīng)較明顯；種子中的黃酮絡(luò)合物生成最多。

表3 原料各活性成分定性檢測(cè)的結(jié)果

注：+：有輕微現(xiàn)象；++：有現(xiàn)象；+++：現(xiàn)象較明顯

2.2 體外抑菌活性的測(cè)定

由圖2、表4可知，除了無(wú)菌水空白對(duì)照組幾乎未產(chǎn)生抑菌圈和95%乙醇對(duì)照組產(chǎn)生較小抑菌圈外，大果沙棗果皮、果肉、種子的提取液均有較顯著的抑菌活性，其中種子提取液的抑菌效果最佳，種子活性成分提取液的抑菌效果由強(qiáng)到弱依次為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>普通變形桿菌>枯草芽孢桿菌，種子提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最明顯，抑菌圈直徑可達(dá)11.0mm；果肉活性成分提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最明顯，抑菌圈直徑可達(dá)7.8mm；果皮活性成分的提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最明顯，最大抑菌圈直徑可達(dá)10.9mm。

表4 各原料提取液抑菌活性的測(cè)定 單位：mm

注：①A：果皮，B：果肉，C：種子；D：無(wú)菌水 E：95%乙醇；②W：抑菌效果，-：W≤2mm；+：2mm8mm

由圖3可知，3種原料活性成分提取液的總體相對(duì)抑制率的大小為種子>果皮>果肉；其中種子提取液對(duì)4種指示菌的相對(duì)抑制率大小為枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>普通變形桿菌>大腸桿菌；果皮活性成分的提取液對(duì)大腸桿菌的相對(duì)抑制率最高，為79.71%；3種原料的活性成分提取液對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌效果。種子對(duì)枯草芽孢桿菌的相對(duì)抑制率為173.68%，果皮次之為100.03%，種子對(duì)金黃色葡萄球菌的相對(duì)抑制率為157.58%，果肉次之為90.91%。

圖3 各原料活性成分提取液的相對(duì)抑制率

3 結(jié)論

采用抑菌圈法對(duì)沙棗果皮、果肉、種子提取液進(jìn)行了抑菌活性的測(cè)定，結(jié)果顯示，3種提取液對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果較顯著，其中種子提取液的抑菌效果最好。3種原料總體的相對(duì)抑制率大小為種子>果皮>果肉，說(shuō)明大果沙棗種子有可拓展的應(yīng)用價(jià)值，果皮、果肉和種子的活性成分的定量分析仍有待進(jìn)一步研究?！?/p>

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