稀土上轉(zhuǎn)換材料活體干細(xì)胞示蹤技術(shù)的研究進(jìn)展

張慧中 綜述 劉凱 審校

在目前的再生醫(yī)學(xué)研究中，干細(xì)胞移植治療始終是重中之重[1]。為了檢驗(yàn)治療與療效的相關(guān)性，所移植干細(xì)胞在宿主體內(nèi)的位置、活性、數(shù)量、停留時(shí)間、分化情況及轉(zhuǎn)歸等，都是至關(guān)重要的評(píng)判依據(jù)[2]。然而，常用的量化檢驗(yàn)手段多基于取樣后的體外組織學(xué)檢測(cè)，在喪失實(shí)時(shí)性、可靠性之余，也無法避免處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或者二次組織創(chuàng)傷。為了解決上述問題，Weissleder等[3]提出了分子影像學(xué)（Molecular Imaging）的概念。此后，建立無創(chuàng)而精確的活體內(nèi)細(xì)胞示蹤方法，逐漸發(fā)展成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。分子影像學(xué)可理解為以量化示蹤體內(nèi)特定的細(xì)胞或分子為目的的動(dòng)物活體成像方法，包含兩大要素，即高親和力的探針和可放大信號(hào)的圖像采集系統(tǒng)[4]。其中，探針包含報(bào)告基因、外源性標(biāo)記物或顯影劑等，成像系統(tǒng)則包含共聚焦熒光顯微鏡、動(dòng)物活體成像儀、MRI、CT、超聲等[5]，兩大元素不同的組合各有優(yōu)勢(shì)與不足。為了能最大化探針的高靈敏度和影像學(xué)的高時(shí)空分辨度，聯(lián)合多種成像優(yōu)勢(shì)的多模態(tài)示蹤技術(shù)備受關(guān)注。在基于光學(xué)成像探針的選擇上，外源性納米標(biāo)記物憑借標(biāo)記方法簡(jiǎn)便、無生物自熒光、高信噪比、低光漂白性、低細(xì)胞光損害等優(yōu)勢(shì)而廣受青睞[6]，尤其是上轉(zhuǎn)換納米材料（Upconcersion Nanoparticle，UCNP）[7]和半導(dǎo)體量子點(diǎn)（Quantum Dot，QD）[8]，而 UCNP 因?yàn)槌煞侄酁橄⊥?，其?xì)胞毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于含有重金屬的QD[9]，故更具優(yōu)勢(shì)。UCNP不僅具備光學(xué)探針?biāo)璧膬?yōu)良屬性，還是極為理想的影像學(xué)造影劑。UCNP的多功能性已在分子靶向結(jié)合探測(cè)、細(xì)胞或器官示蹤發(fā)光成像、影像學(xué)造影、腫瘤光敏治療等領(lǐng)域得到了廣泛的研究開發(fā)，并有望建立分子影像學(xué)臨床應(yīng)用的納米材料平臺(tái)[10]，其在干細(xì)胞治療的機(jī)理探究中也將發(fā)揮無可估量的推動(dòng)作用。

1 稀土上轉(zhuǎn)換材料的研發(fā)和制備

1.1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光的概念及發(fā)展

上轉(zhuǎn)換發(fā)光（Upconversion Luminescence，UCL）的定義是：連續(xù)吸收兩個(gè)或多個(gè)低能量、波長較長的入射光子并將其轉(zhuǎn)變成一個(gè)高能量、波長較短的發(fā)射光子的非線性光學(xué)過程[7]。其中所吸收的激發(fā)光通常為波長980 nm（組織穿透力極高）的近紅外光（Near Infrared，NIR）[11]。而常用的如綠色熒光蛋白（GFP）、熒光素酶（luciferase）等有機(jī)熒光探針的發(fā)光原理與之正相反，為高能量光（通常為穿透力較差、對(duì)細(xì)胞損害較大的紫外光[12]）激發(fā)出低能量可見光，稱為下轉(zhuǎn)換發(fā)光（Downconversion Luminescence，DCL）[13]， 又稱為斯托克發(fā)光（Stokes Emission）[14]，因而 UCL又被稱作反斯托克發(fā)光（Anti-Stokes Emission）[15]。 UCL 的概念最早由 Auzel等[16]基于 Bloembergen[17]的假說所提出并研發(fā)，經(jīng)改良拓展逐步投入到生物、藥物檢測(cè)等分子影像學(xué)的應(yīng)用中。

1.2 UCNP的制備

目前，為了制備上轉(zhuǎn)換材料，稀土元素仍是必不可少的，尤其是鑭系元素 （Ln series）離子，包括釔Y3+、鐿Yb3+、釓Gd3+、鉺 Er3+、鈥 Ho3+、銩 Tm3+等，其相對(duì)含量對(duì)于材料的上轉(zhuǎn)換性能、生物安全性等均有決定性影響[18]。常用的稀土上轉(zhuǎn)換材料是通過在固體晶格（多為氟化物）中摻雜稀土離子得到的。其中上轉(zhuǎn)換理化特性俱佳的NaYF4是目前應(yīng)用最廣且最為理想的固體晶格[7]，離子半徑相對(duì)最小的Yb3常被用作敏化劑，上轉(zhuǎn)換特性最為突出的Er3+、Ho3+、Tm3+則常被作為激活劑[18]，通常 書 寫為 NaYF4:Yb3+/Er3+或 NaYF4:Yb3+/Tm3+等[19-20]。在980 nm激發(fā)光下，UCNP可發(fā)出可見光及波長為800 nm左右的不可見光，其中摻有Er3+的材料所發(fā)可見光為綠色，摻有Tm3+的材料則為藍(lán)紫色，摻有Ho3+的材料則為紅色。而根據(jù)元素的比例等因素，所發(fā)光的波長可有大幅區(qū)別，從而使熒光成像的收集波長區(qū)域的設(shè)置更為靈活，因800 nm波長光組織穿透性更佳，故可將其設(shè)為收集波長范圍，以提高熒光探測(cè)的靈敏度。鑒于稀土上轉(zhuǎn)換材料粒徑極小（10～500 nm不等[21]），故統(tǒng)稱作上轉(zhuǎn)換納米材料（Upconcersion Nanoparticle/Nanophosphor，UCNP）。在不同時(shí)間段及不同條件的制備下，UCNP的形態(tài)各有不同，近期研究最常見的為六方相（Hexagonal-phase）的UCNP，其上轉(zhuǎn)換效率最受認(rèn)可，但亦有研究提出立方相的UCNP具有更強(qiáng)的組織穿透力[22]。為了增加UCNP的親水性和生物相容性，需加一定的表面修飾，常用的包括二氧化硅、半胱氨酸、聚合物（PAA、PEG、PEI）、右旋糖酐、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）等進(jìn)行外殼包裹[23]。綜上可見，表面修飾的NaYF4:敏化劑/激活劑的六方相UCNP是目前較為經(jīng)典的材料制備模式，但并不受局限，根據(jù)研究需要可使用不同的材料組合賦予相應(yīng)的功能。目前常用的合成UCNP的方法包括水熱法、熱分解法、液相共沉淀法、微乳液法、溶膠-凝膠法等，對(duì)于成品的形狀、粒徑、發(fā)光顏色及強(qiáng)度等皆可靈活調(diào)控[24]。

2 UCNP示蹤干細(xì)胞的應(yīng)用

2.1 UCNP標(biāo)記干細(xì)胞的方法共識(shí)

常用的有機(jī)熒光探針如GFP、RFP、EGFP等標(biāo)記細(xì)胞的方式主要為病毒轉(zhuǎn)染，納米材料如量子點(diǎn)（QD）需要通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔或穿膜肽等方法[25]，操作及耗材成本均較高。而UCNP標(biāo)記細(xì)胞主要通過胞吞作用（Endocytosis）[26]，僅需將UCNP的顆粒混懸液與細(xì)胞共培養(yǎng)，材料即可隨囊泡包裹進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。因UCNP是作為細(xì)胞內(nèi)異物存在，故被胞吐后影響細(xì)胞示蹤作用是一大問題。Zhao等[27]用transwell實(shí)驗(yàn)證明了14 d內(nèi)攝取了UCNP的大鼠BMSC無明顯的胞吐現(xiàn)象，Ma等[19]所研究的UCNP可在兔BMSC內(nèi)停留至少21 d，并提出UCNP從囊泡內(nèi)溢出進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)后停留時(shí)間可相對(duì)更久，可見UCNP有極大的長期標(biāo)記干細(xì)胞的潛力。雖然標(biāo)記方法簡(jiǎn)便，但是共培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞密度、UCNP相對(duì)細(xì)胞的濃度、共培養(yǎng)時(shí)間和條件、細(xì)胞應(yīng)呈貼壁或懸浮狀態(tài)等問題都會(huì)對(duì)UCNP的攝取效率有所影響，因此所采取的方案也各有不同。Abdul等[28]通過將成分為硅殼修飾的NaYF4:Yb3+/Er3+以100 μg/mL的混懸液濃度分別與貼壁的Wistar大鼠的BMSC及成肌細(xì)胞（肌肉前體細(xì)胞）共培養(yǎng)24 h。Idris等[29]為了提高UCNP攝取效率、節(jié)省初始共培養(yǎng)用量，在細(xì)胞懸浮狀態(tài)下，將硅殼修飾的 NaYF4:Yb/Er（0～100 μg/mL）與鼠成肌細(xì)胞共培養(yǎng)40 min，UCNP攝取效率相對(duì)更高。此文獻(xiàn)為僅有的關(guān)于UCNP與細(xì)胞混懸液共培養(yǎng)的報(bào)道，而細(xì)胞懸浮狀態(tài)的攝取效率與貼壁狀態(tài)之間的差異尚無結(jié)論。UCNP與干細(xì)胞共培養(yǎng)的最適時(shí)間也缺乏共識(shí)，在0.5～24 h間均有文獻(xiàn)報(bào)道[19]，最適標(biāo)記濃度在50～100 μg/mL左右[27-33]。而對(duì)于細(xì)胞適應(yīng)能力較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記，濃度與時(shí)間相對(duì)靈活。Chatterjee等[34]將PEI修飾的NaYF4:Yb3+/Er3+以5 mg/mL的混懸液濃度與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，并證明對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響。目前尚無關(guān)于UCN的標(biāo)記飽和濃度的研究報(bào)道。共培養(yǎng)的環(huán)境條件基本均為37℃、5%CO2，標(biāo)記的細(xì)胞基本為70%～80%融合。為了去除未被攝取的UCNP，基本都采用PBS反復(fù)沖洗。為了在操作上盡量減少UCNP的團(tuán)聚現(xiàn)象，超聲振蕩分散最為常用，也有選用0.22 μm膜過濾去除結(jié)塊的材料[19]。

2.2 UCNP的生物安全性檢測(cè)

作為潛在的臨床轉(zhuǎn)化的生物應(yīng)用材料，UCNP的生物安全性需要足夠嚴(yán)格完整的檢驗(yàn)，目前已有大量研究多方面認(rèn)可了其突出的低細(xì)胞毒性、高生物相容性等優(yōu)勢(shì)，而在活體內(nèi)代謝的規(guī)律也有極重要的評(píng)估意義。

2.2.1 細(xì)胞毒性檢測(cè)

目前，針對(duì)UCNP對(duì)干細(xì)胞的細(xì)胞毒性檢測(cè)，其觀察的材料共培養(yǎng)時(shí)間通常為12～48 h，久于所采用的UCNP工作標(biāo)記時(shí)間，所研究的材料濃度梯度范圍基本在0～200 μg/mL。Ma等[19]測(cè)得 PAH-PAA 修飾的 NaYF4:Yb/Er以 100～200 μg/mL標(biāo)記24 h后，兔BMSC活性分別為56%和44%；Li等[30]測(cè)得RGD-硅殼修飾的NaYF4:Yb/Tm以100 μg/mL標(biāo)記48 h后，hBMSC活性仍大于80%，而在30 min持續(xù)近紅外光（NIR）照射下，細(xì)胞活性與對(duì)照組無明顯差異。上述結(jié)果的差異較大，可能與結(jié)合的修飾分子和細(xì)胞來源有一定關(guān)系。Abdul等[28]將UCNP分別標(biāo)記BMSC和成肌細(xì)胞，證實(shí)對(duì)環(huán)境更敏感的BMSC的活性受UCNP影響相對(duì)更大。Xu等[31]驗(yàn)證了200 μg/mL的PEG-PEI修飾的NaYGdF4:Yb/Er對(duì)人羊水干細(xì)胞（Amniotic Fluid Stem Cell，AFSC）的增殖沒有明顯影響。以上研究均在干細(xì)胞與UCNP共培養(yǎng)后即刻行CCK8或者M(jìn)TT實(shí)驗(yàn)，而Zhao等[27]選擇先共培養(yǎng)再換為新鮮培養(yǎng)液24 h后再進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)試，所用UCNP為PEI修飾的NaYbF4:Tm/CaF2，測(cè)得100 μg/mL孵育24 h后的干細(xì)胞活性小于60%。相比之下，UCNP對(duì)腫瘤細(xì)胞的活性影響明顯更低。Sun等[35]的研究顯示，檸檬酸修飾的NaLuF4:Yb,Tm以1 mg/mL標(biāo)記48 h后，人口腔表皮樣癌細(xì)胞（KB cells）的活性仍大于90%。Ma等[36]用 800 μg/mL的 LaF3:Yb,Tm標(biāo)記人胃癌細(xì)胞 （MGC-803 cells）12 h后，細(xì)胞活性仍大于60%。可見不同成分的UCNP針對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性差異較大。以上細(xì)胞活性均隨UCNP濃度增加而下降，但Wei等[37]發(fā)現(xiàn)半胱氨酸修飾的UCNP的標(biāo)記濃度越高，所標(biāo)記的HeLa細(xì)胞活性越高，可能是因?yàn)榘腚装彼岬母哂H和力促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。

2.2.2 對(duì)干細(xì)胞多向分化能力的影響

Hsieh等[38]發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)（QD）會(huì)削弱hBMSC成軟骨的性能，可能是由于QD以被囊泡包裹的形式聚集在細(xì)胞核周圍而影響了細(xì)胞器的功能。但UCNP對(duì)于干細(xì)胞分化性能的影響則極小，從而也體現(xiàn)出了相比于QD的優(yōu)勢(shì)。在成軟骨方面，Hu等[32]驗(yàn)證了以氟磷灰石為晶格基質(zhì)的UCNP在50 μg/mL的標(biāo)記濃度下對(duì)BMSC成軟骨體內(nèi)、外誘導(dǎo)均無明顯影響。而成骨方面，Ma等[19]證實(shí)了標(biāo)記濃度大于100 μg/mL的UCNP對(duì)兔BMSC的成骨能力有顯著影響，但50 μg/mL的UCNP則無明顯影響。Zhao等[27]等證明BMSC與100 μg/mL濃度的UCNP共培養(yǎng)4 h后仍可正常成骨和成脂分化。Liang等[33]證明了 PEG、PEI修飾的 UCNP在標(biāo)記濃度為 200 μg/ml時(shí)對(duì)人羊水干細(xì)胞的成骨分化能力沒有顯著影響。

2.2.3 生物分布檢測(cè)

對(duì)于UCNP在活體內(nèi)的定位定量檢測(cè)，目前有報(bào)道的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為裸鼠，常用方法為980 nm激發(fā)活體熒光成像確定UCNP在各個(gè)臟器內(nèi)的分布，并對(duì)各個(gè)主要臟器進(jìn)行利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法 （ICP-AES）檢測(cè)精確含量。Nyk等[39]通過將成分為NaYF4:Yb3+/Tm3+的UCNP尾靜脈注射入Balb C小鼠體內(nèi)，2 h后通過Maestro成像系統(tǒng)完成了首次活體上轉(zhuǎn)換成像，可見到UCNP在臟器內(nèi)的分布，但清晰度有限。Abdul等[28]以10 mg/Kg的濃度（組織中ICP可檢測(cè)到的最低濃度）將UCNP混懸液由尾靜脈注射入Wistar大鼠體內(nèi)，分別于不同時(shí)間點(diǎn)取材并利用ICP-AES檢測(cè)各個(gè)臟器內(nèi)的UCNP含量。經(jīng)觀察，注射后大鼠的健康狀態(tài)正常，ICP示30 min內(nèi)UCNP大量集中于肺部，肝臟其次，24 h后各臟器中均急劇減少，7 d后基本通過尿路排盡，顯示良好的生物安全性。Chatterjee等[34]將濃度為10 μg/mL的UCNP尾靜脈注射入Wistar大鼠，得到同樣結(jié)果。Wei等[37]通過活體生物成像儀檢測(cè)裸鼠全身以及取出的各個(gè)臟器，同樣觀察到肺和肝臟的熒光信號(hào)最強(qiáng)。UCNP最先積聚于肺部的現(xiàn)象與干細(xì)胞治療中在肺部大量集中的現(xiàn)象類似[31，40]。因此，將UCNP標(biāo)記的干細(xì)胞停留在指定位置的效率將是今后研究中需要重視的關(guān)鍵問題。

3 UCNP上轉(zhuǎn)換成像示蹤移植干細(xì)胞的研究

3.1 體外標(biāo)記干細(xì)胞成像

為了驗(yàn)證UCNP標(biāo)記細(xì)胞的作用，Abdul等[28]通過將UCNP以0～100 μg/mL的混懸液濃度分別與Wistar大鼠的BMSC及肌成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，然后徹底洗去未被攝入的UCNP，在980 nm激發(fā)光的共聚焦熒光顯微鏡下觀察，可見發(fā)出綠色熒光的UCNP均勻分布于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核周圍，基本構(gòu)成了細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)。Idris等[29]通過5 h的延時(shí)共聚焦熒光顯微鏡拍攝記錄了UCNP標(biāo)記的成肌細(xì)胞在體外低血清含量環(huán)境下的遷移，觀察到2.5 h時(shí)可見細(xì)胞互相靠近，5 h時(shí)可見細(xì)胞自行排列成直線形軌跡。為了提高上轉(zhuǎn)換成像質(zhì)量，Yu等[41]研制了一套激光掃描上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像顯微鏡 （Laser scanning up-conversion luminescence microscopy，LSUCLM）。Xiong等[42]首次使用LSUCLM對(duì)UCNP標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行清晰顯影。

3.2 體內(nèi)上轉(zhuǎn)換成像示蹤干細(xì)胞

為了驗(yàn)證UCNP在活體內(nèi)可探測(cè)到的深度，Chatterjee等[34]將100 μL的4.4 mg/mL的UCNP皮下注射入裸鼠腹股溝、背部、腹部（深度約10 mm），用980 nm激光器照射，CCD收集成像。剝?nèi)テつw暴露肌肉的實(shí)驗(yàn)組UCNP熒光肉眼清晰可見，強(qiáng)度明顯大于有皮膚未暴露肌肉的對(duì)照組，而100 μL的QD僅可在皮膚較透明的足部皮下見到其綠色熒光。Idris等[29]通過25 μg/mL濃度的UCNP標(biāo)記觀察到成肌細(xì)胞注射移植入肌肉創(chuàng)面后3 d內(nèi)所移植細(xì)胞從注射點(diǎn)向遠(yuǎn)處擴(kuò)散，但熒光信號(hào)于第7天顯著減少，其原因可能為：①UCNP隨細(xì)胞增殖和胞吐而被稀釋；②宿主免疫系統(tǒng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，該研究還通過共聚焦顯微鏡觀察UCNP標(biāo)記的成肌細(xì)胞尾靜脈注射后在大鼠耳部血管的分布，實(shí)現(xiàn)了無生物自熒光、高信噪比的單個(gè)細(xì)胞的活體示蹤。Liang等[33]驗(yàn)證了PEG修飾的UCNP在Balb C小鼠背部皮下注射后，通過改良的Maestro活體成像系統(tǒng)顯示的熒光信號(hào)強(qiáng)度和所注射的細(xì)胞量成正比，且可精確到捕捉10個(gè)干細(xì)胞的信號(hào)，而QD、超順磁性氧化鐵顆粒（USPIO）能檢測(cè)到的細(xì)胞量至少上千個(gè)[43]。之后他們還成功地利用UCNP活體示蹤了尾靜脈移植入急性肺損傷模型的羊水干細(xì)胞。

4 UCNP結(jié)合特定分子的功能對(duì)干細(xì)胞靶向示蹤應(yīng)用的啟示

除了熒光成像所嚴(yán)格要求的高信噪比、光穩(wěn)定性、生物安全性等絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，UCNP尚有一極為關(guān)鍵的功能，即可結(jié)合任何類型的功能團(tuán)。最為常用的方法為通過配體交換法[37]、配體氧化法[44]、SiO2包裹法[28]等使原本表面為疏水的巰水基的UCNP表面最終帶有親水的氨基、羧基或巰基，從而獲得了與各類生物分子共價(jià)偶聯(lián)的能力，并可廣泛運(yùn)用于靶向相關(guān)的生物應(yīng)用中。針對(duì)干細(xì)胞，Li等[30]將促軟骨化藥物Kartogenin（KGN）通過光敏籠狀連接物（Photocaged linker）結(jié)合于 RGD、硅殼修飾的UCNP，使之被hBMSC攝入，并實(shí)現(xiàn)了光敏調(diào)控干細(xì)胞的分化。光敏的主要原理為：經(jīng)近紅外光NIR刺激，UCNP釋放紫外光，使光敏連接物產(chǎn)生光裂解，其中的KGN得到釋放并作用于干細(xì)胞。此外，UCNP在干細(xì)胞的靶向運(yùn)用方面鮮有報(bào)道，但在免疫和腫瘤檢測(cè)方面的應(yīng)用是其向干細(xì)胞方向推廣的重要參考。

4.1 結(jié)合抗體用于免疫檢測(cè)及靶向治療

2000年，UCNP就已經(jīng)廣泛應(yīng)用于免疫層析檢測(cè)[45]，主要用于食品藥品檢測(cè)方面[46-47]，醫(yī)學(xué)生物方面可檢測(cè)人乳頭瘤病毒、hCG、雌二醇等[48]。在免疫細(xì)胞組織化學(xué)方面，Zijlmans等[49]用結(jié)合了親和素和CD44的UCNP成功識(shí)別了鼠前列腺特異性抗原及人淋巴細(xì)胞。2001年，他們成功開發(fā)了UCNP作為DNA芯片的功能，并提出非特異性結(jié)合可用封閉劑避免[48]。Nagarajan等[50]驗(yàn)證了結(jié)合了間隙黏連蛋白抗體的UCNP可特異性標(biāo)記，與BMSC共培養(yǎng)心臟細(xì)胞H9c2。Xiang等[51]通過結(jié)合了特異性抗原的UCNP靶向識(shí)別C57BL/6鼠體內(nèi)的樹突狀細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)更高效的疫苗注射。

4.2 腫瘤靶向探針的應(yīng)用

Chatterjee等[34]將葉酸共價(jià)結(jié)合于UCNP，與腺癌細(xì)胞HT29、卵巢癌細(xì)胞OVCAR3（均過表達(dá)葉酸受體）共培養(yǎng)24 h，顯示其被細(xì)胞攝入明顯多于未結(jié)合葉酸的UCNP，證明了此法可特異性標(biāo)記腫瘤細(xì)胞。Xiong等[52]使用結(jié)合葉酸的UCNP尾靜脈注射入分別移植了HeLa細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)，注射后24 h可見在Hela腫瘤中有大量UCNP熒光信號(hào)，而MCF-7腫瘤中則極少，從而驗(yàn)證了結(jié)合葉酸的UCNP可作為過表達(dá)葉酸受體的HeLa腫瘤的特異性活體靶向探針。他們還用同樣的方法驗(yàn)證了UCNP可作為過表達(dá)αvβ3整合素受體的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的特異性靶向探針[42]。

腫瘤中過表達(dá)的分子常有極高的特異性，因而UCNP的研究大量集中于腫瘤靶向診治。但在不同的組織缺損或病理區(qū)域中也會(huì)有特異性表達(dá)的生物標(biāo)記，若可以提升靶向定位的特異性分子的靈敏度，結(jié)合UCNP的攜帶作用及良好的生物相容性，即可為提高干細(xì)胞歸巢效率等提供新方法。

5 上轉(zhuǎn)換成像結(jié)合影像學(xué)檢測(cè)的多模態(tài)示蹤系統(tǒng)的應(yīng)用

UCNP雖有獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換成像性能，但其靈敏度和空間分辨率遠(yuǎn)不及CT，而CT則缺乏MRI的解剖探測(cè)深度?？上驳氖?，UCNP同樣具備理想的影像學(xué)造影屬性，可與UCL、MRI、CT結(jié)合后成為多模態(tài)成像示蹤系統(tǒng)。

5.1 UCNP的MRI造影應(yīng)用

由于MRI的縱向弛豫T1造影劑Gd-DTPA中的Gd是稀土元素中的一種，具有強(qiáng)磁性，故摻入Gd的UCNP具有T1的MRI造影能力，以Gd2O3為固體晶格的UCNP的顯影信號(hào)甚至強(qiáng)于Gd-DTPA[53]。Liu等[54]驗(yàn)證了結(jié)合抗-EGFR抗體的NaGdF4:Yb/Er可靶向識(shí)別裸鼠體內(nèi)的腫瘤并在MRI中顯影。在橫向馳豫T2方面，臨床常用的造影劑Feridex成分為超順磁性氧化鐵顆粒 （USPIO），故結(jié)合USPIO即可賦予UCNP橫向馳豫T2的MRI造影能力。Zhou等[55]將結(jié)合氧化鐵的UCNP注射入裸鼠的前掌，通過T2信號(hào)增強(qiáng)的MRI以及上轉(zhuǎn)換成像UCL對(duì)其淋巴結(jié)進(jìn)行清晰顯影。除了結(jié)合SPIO，摻入具鐵磁性的鈷Co2+亦可賦予T2的MRI造影能力。Xia等[56]用摻入Co2+的NaYF4:Yb/Tm作為造影劑經(jīng)靜脈注射實(shí)現(xiàn)了裸鼠的活體T2顯影。綜上所述，利用MRI對(duì)于深層解剖結(jié)構(gòu)的精確顯影，結(jié)合UCNP光學(xué)成像的基本定位，從而對(duì)于干細(xì)胞在較深組織中的位置可進(jìn)行更準(zhǔn)確的定位定量。因此，結(jié)合多種成像方式的多模態(tài)成像系統(tǒng)目前備受重視[5]。

5.2 UCNP的CT造影應(yīng)用

稀土元素本身即具備一定的CT顯影強(qiáng)度，其中Gd同樣較為常用。He等[57]證實(shí)了NaGdF4:Yb/Er在裸鼠皮下可經(jīng)CT顯影。然而，為了使顯影強(qiáng)度增加，即X射線衰減系數(shù)增強(qiáng)（X-ray attenuation coefficient），需要增加固體晶格內(nèi)稀土元素的含量比例，并選擇原子數(shù)更高的稀土元素合成固體晶格。Ma等[36]選擇了LaF3作為晶格，其中鑭La3+的含量比例較常用晶格更高，合成的UCNP在肌肉內(nèi)經(jīng)CT可清晰區(qū)別于周圍軟組織顯影。Sun等[35]則選用NaLuF4作為晶格，其中镥Lu3+是原子量最大的稀土鑭系元素，所制得的UCNP的X射線衰減系數(shù)明顯高于常用造影劑碘普羅胺（Iopromide），從裸鼠足部注射，經(jīng)CT三維重建得到了與上轉(zhuǎn)換成像一致的腿部淋巴管的形態(tài)分布。Xing等[58]選用了BaYbF5作為晶格，驗(yàn)證了BaYbF5:Er的X射線衰減系數(shù)顯著強(qiáng)于常用造影劑碘比醇（Iobitridol）。結(jié)合相關(guān)的核素，UCNP可成為SPECT/CT的理想造影劑。Kostiv等[59]將125I標(biāo)記的NaYF4:Yb/Er經(jīng)尾靜脈注射，通過SPECT/CT成像可觀察到30 min內(nèi)即在肝臟聚集顯影。

6 關(guān)于UCNP在干細(xì)胞示蹤方面應(yīng)用的展望

從材料研發(fā)角度來看，所采用的元素在保證UCNP的上轉(zhuǎn)換發(fā)光性能以及影像學(xué)造影性能的同時(shí)，還需注意其粒徑大小和生物安全性。此外，由于UCNP在液體中的分散性對(duì)于其轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率有著關(guān)鍵作用，故其表面的生物相容性修飾也不可或缺。在標(biāo)記細(xì)胞方面，目前已有的研究對(duì)于所采用的標(biāo)記濃度、方法、時(shí)間、條件基本趨于一致，相比于耐受性極強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞，干細(xì)胞的標(biāo)記濃度和時(shí)間均受到一定的局限，從而對(duì)于實(shí)現(xiàn)更高強(qiáng)度的上轉(zhuǎn)換熒光成像和影像學(xué)顯影形成一定的挑戰(zhàn)。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇方面，由于上轉(zhuǎn)換熒光活體成像儀器大小和普及度的局限，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物局限于體型較小的裸鼠或大鼠，而熒光的穿透深度常受毛發(fā)及皮膚厚度的限制，目前已實(shí)現(xiàn)可穿透黑色毛發(fā)達(dá)到2 cm深度的上轉(zhuǎn)換熒光[22]。UCNP在腫瘤相關(guān)的靶向應(yīng)用已日趨成熟，而干細(xì)胞相關(guān)的研究則相對(duì)欠缺，缺乏標(biāo)記細(xì)胞的各種標(biāo)準(zhǔn)。目前，干細(xì)胞治療的確切機(jī)制以及靶向歸巢作用，是限制該領(lǐng)域發(fā)展的兩大障礙。UCNP的多模態(tài)分子影像學(xué)的潛能有可能極大地推動(dòng)該領(lǐng)域的進(jìn)展。期待能更多地開展UCNP示蹤并靶向引導(dǎo)不同干細(xì)胞治療的研究，實(shí)現(xiàn)更高效的基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)，并明確機(jī)制和最終的臨床轉(zhuǎn)化。