淺談食品中蛋白質含量測定方法優(yōu)缺點

□ 常 虹 海南省食品檢驗檢測中心 唐 帥 海南省食品藥品檢驗所瓊海分所 羅小菊 海南省食品檢驗檢測中心

1 常規(guī)食品中蛋白檢驗方法

食品中蛋白質是人類最重要的營養(yǎng)物質之一，準確測定蛋白質含量是食品檢驗工作的一項重要內容[1]。食品中蛋白質的測定具有十分重要的現(xiàn)實意義，食物中準確的蛋白質含量為合理配膳提供數(shù)據(jù)，掌握食品的營養(yǎng)價值和品質的變化，保證不同人群對蛋白質的需要[2-3]。

目前，我國的現(xiàn)行國家標準中有3個可以測定食品中蛋白質的理化方法，分別為GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》中的第一法凱氏定氮法、第二法分光光度法、第三法燃燒法[4]。此外，還有雙縮脲法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）等檢驗方法，可以對食品中的蛋白質進行定性和定量的測定。作為食品理化檢驗工作從業(yè)者，筆者結合平時的檢驗經(jīng)驗，分析檢驗標準淺談凱氏定氮法、分光光度法、燃燒法、雙縮脲法（Biuret法）的優(yōu)缺點，同時參考相關文獻，以進一步證實筆者的總結。

2 各類方法優(yōu)缺點比較

2.1 凱氏定氮法

2.1.1 測定原理

在催化加熱條件下，食品中的蛋白質被分解，分解后的產(chǎn)物氨與硫酸結合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收游離氨后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質的含量。凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法[5]。在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣餾出并被過量的酸液吸收，再以標準堿滴定，根據(jù)標準溶液的消耗量計算出樣品中的氮量。

2.1.2 優(yōu)缺點分析

優(yōu)點：①測定結果相對準確，重現(xiàn)性好，在國內各大檢驗機構中比較普及；②靈敏度低、干擾少，適用于0.2～1.0 mg氮，誤差為±2%。

缺點：①一般測定時間為8～10 h，費時且試劑消耗量大；②有局限性，即難以把有機物定量轉變成氨，特別是含有硝酸鹽的樣品會影響總氮的結果，影響測定準確性。

2.2 分光光度法

2.2.1 測定原理

在催化加熱條件下，食品中的蛋白質被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，其在pH 4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應生成黃色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400 nm下測定化合物吸光度值，將其與標準系列進行比較定量，結果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質含量。

2.2.2 優(yōu)缺點分析

優(yōu)點：①簡化了操作，省去了蒸餾、滴定的步驟，使用常見的分光光度計，便于廣泛推廣應用，為蛋白質的測定提供了凱氏定氮法的簡化方法；②消化時間相對較短，所用消化設備簡便，常用，易于推廣測量靈敏度高、快速，方便低濃度蛋白質含量可檢測。本法采用硫酸銨作為銨離子標準溶液，避免引入其他雜質。

缺點：易受溶液中雜質的影響、干擾因素較多，存在潛在的偏差，標準曲線不易繪制精確。

2.3 燃燒法

2.3.1 測定原理

試樣在900～1 200 ℃高溫下燃燒，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體，氮氧化物被全部還原成氮氣，其中的碳、硫等干擾氣體和鹽類被吸收管吸收，形成的氮氣氣流通過熱導檢測儀（TCD）進行檢測。

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2.3.2 優(yōu)缺點分析

優(yōu)點：①操作簡便，檢測周期短檢測樣品無需消化，自動進樣，5～8 min即可完成一個樣品的檢測；②檢測數(shù)據(jù)誤差更低，由于凱氏定氮法與燃燒法在實驗原理上的不同，在實際檢測中，同個樣品用兩種方法檢測有時會出現(xiàn)不同的結果，而且實驗發(fā)現(xiàn)燃燒法檢測出來的數(shù)據(jù)略高于凱氏定氮法；燃燒法能夠將樣品中的氮元素全部檢測出來，以動物性蛋白樣品為例，凱氏法只能測定出其中的有機氮，而燃燒法可以測出有機氮和無機氮；③檢測過程少污染，蛋白質燃燒法檢測過程中不產(chǎn)生有毒有害物質，清潔，環(huán)保。

缺點：①對于不均勻的復雜樣品分析難度較大，樣品需要確保研磨均勻而且要較細顆粒，否則易出現(xiàn)燃燒不完全的情況，進而影響后續(xù)的檢測結果；②儀器耗材消耗快，儀器昂貴，檢測成本高，在凈化過程中，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體被適當?shù)奈談┏?。這些吸收劑在大批量的樣品檢測中有較大的消耗量，需經(jīng)常更換。而且燃燒法中用到的儀器杜馬斯定氮儀本身價格較為昂貴，因此限制了這一方法的推廣和應用。

2.4 雙縮脲法（Biuret法）

2.4.1 測定原理

雙縮脲法是一個可以用于鑒定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑是堿性的含銅試液，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配制，呈藍色。當?shù)孜镏泻须逆I（多肽）時，試液中的銅與多肽配位，生成的配合物呈紫色[6]。在紫外可見光譜中的波長為540 nm，可通過比色法分析濃度。檢測反應的靈敏度為5～160 mg/mL。

2.4.2 優(yōu)缺點分析

優(yōu)點：較快速，不同的蛋白質產(chǎn)生顏色的深淺相近，干擾物質較少。

3 結語

基于凱氏定氮法的重現(xiàn)性較好，即便其消化時間長，目前國內各大檢驗機構主要采用常規(guī)凱氏定氮法。原因在于先進的蛋白質測定儀價格昂貴，且需專門試劑，目前尚難普及[7]。然而，就檢驗時效而言，凱氏定氮法確實越來越難以滿足目前市場的要求，故應當從改進凱氏定氮法消化時間方面進行技術方面的改進[8]。目前已有相關文獻對于凱氏定氮法的消化過程進行改進：用過氧化氫-硫酸混合液為消化試劑，加液方式由一次性加入改為定時定量、逐滴緩慢加入，取代了凱氏定氮法復雜的消化體系和操作步驟，使反應更加充分、快速[9]。因此，顯著縮短了消化時間，是常規(guī)消化法消化時間1/12。樣品經(jīng)快速消化法消化后，其粗蛋白含量測定結果與常規(guī)消化法基本一致。說明快速消化法不僅消化效果完全、可靠，而且省時、快速，尤其適合于大批量蛋白質的測定分析。

國 家 標 準 GB 5009.5-2016 中 的第三法燃燒法是比較理想的快速便捷方法，但由于儀器耗材消耗快，儀器昂貴，檢測成本高，在凈化過程中，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體被適當?shù)奈談┏?。這些吸收劑在大批量的樣品檢測中有較大的消耗量，需經(jīng)常更換（如用來吸收酸的鐵絲，用來吸收氯的黃銅，用來吸收多余氧化物的碳粒以及吸水劑高氯酸鎂等）。而且燃燒法中用到的儀器杜馬斯定氮儀本身價格較為昂貴，因此限制了這一方法的推廣和應用。當然，有條件的實驗室可以應用該方法，建議收集各實驗室的數(shù)據(jù)加以進一步驗證該方法的準確性。

綜上所述，蛋白質的檢測方法各有優(yōu)缺點，檢驗檢測機構應該結合本單位實際，選用符合本單位的檢驗檢測方法去進行相關檢測工作。