海蜇膠原蛋白保濕霜的研制

鄭永軍，杜國豐，劉辰鍶，任 毅，周雪健，柳琳璇，李慧晗

(營口理工學(xué)院，遼寧 營口 115014)

海蜇(拉丁名: Rhopilema esculentu)是一種生活在海洋中的無脊椎軟體動物，在遼東灣河口地區(qū)有可觀的捕撈資源。海蜇既是一種高蛋白低脂肪食品，也是一味中藥材，在食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有巨大的開發(fā)前景。新鮮海蜇含水率大約96%，是地球上含水量最高的生物，具有神奇的保水、保濕功能[1]。本文以營口地區(qū)豐富的海蜇資源為原料，采用現(xiàn)代分離技術(shù)提取海蜇中高性能保濕功能成分，并將其開發(fā)成高端天然保濕功能化妝品，不僅可以提高海蜇產(chǎn)品的科技含量和附加值，而且拓寬了海蜇功能成分的應(yīng)用領(lǐng)域，拉長了海蜇產(chǎn)業(yè)鏈條，有重要學(xué)術(shù)價值和廣闊應(yīng)用前景，對于遼寧省海洋資源的開發(fā)利用具有十分重要的現(xiàn)實意義。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

BILON92-IID型超聲波細胞破碎儀(深圳市天章機械設(shè)備有限公司)；TDL-40B型低速大容量離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HH-G型數(shù)顯恒溫水水浴鍋(國華電器有限公司)；JYL-C022E型料理機(九陽股份有限公司)；GZX-9023MBE型數(shù)顯鼓風干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器(上海亞榮生化儀器廠)；PHS-3C型精密酸度計(上海大普儀器有限公司)； DP-SAII-2型實驗室乳化機(北京亞歐德鵬科技有限公司)多功能數(shù)字皮膚測試儀(北京伊麗美科技有限公司)

1.2 材料和試劑

鹽漬海蜇皮購于營口市水產(chǎn)批發(fā)市場。其他試劑為國產(chǎn)，分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 超聲波輔助提取海蜇膠原蛋白

(1)脫鹽處理：將從市場上采購的鹽漬海蜇皮，先用自來水清洗3遍，然后放入水池用流水浸泡12h，再用去離子水浸泡12 h，進行脫鹽處理，并用蒸餾水重復(fù)清洗至沒有氯離子為止。

(2)粉碎處理：將脫鹽處理后的海蜇皮，用不銹鋼剪刀剪成小塊。取一定量的海蜇皮，加入質(zhì)量濃度為167g/L的檸檬酸50ml浸泡3h，加入6倍蒸餾水，用JYL-C022E型料理機搗碎勻漿15min，然后將粉碎好的料液冷藏12h。

(3)超聲波輔助提?。涸谝欢ǖ膶嶒灉囟葪l件下，將料液放入BILON92-IID型超聲波細胞破碎儀中，持續(xù)30min。

(4)離心分離：將超聲波處理后的料液，放入4000rpm高速離心機中，離心20min，分離出上清液海蜇膠原蛋白制品。

1.3.2 海蜇膠原蛋白成分的測定

(1)海蜇提取物水分的測定：準確稱取一定量的海蜇膠原蛋白提取液，放入恒溫干燥箱中，在105℃下烘干3小時后取出，放入玻璃干燥器中冷卻并稱重，再把樣品放入干燥箱烘干0.5h，直至前后兩次的重量差不超過0.002g，按固形物含量(%)(X)公式(1)計算。水分含量(%)=1-X。

(1)

式中：m1——恒重后稱量皿重量，g；

m2—恒重后稱量皿和樣品重量，g；

W——樣品重量，g。

(2)海蜇提取物蛋白質(zhì)含量的測定：海蜇提取物中蛋白質(zhì)的含量，采用凱氏定氮法(GB 5009.5-2010)測定[2]。

(3)海蜇提取物中脂肪含量的測定[3]：首先，切碎原材料，各稱10g放入燒杯中，依次加入甲醇60mL，氯仿30mL并依次攪拌2min，1min；然后將混合物用勻漿機勻漿，用氯仿洗勻漿杯，用量為30mL，之后將洗液與勻漿液混合，攪拌均勻后靜置 2min，然后進行抽濾，再用 60ml 氯仿洗濾紙、殘渣和容器之后再抽濾，最后將上述濾液合并至分液漏斗中，加入0.5%醋酸鋅35mL后振蕩搖勻，靜置過夜分層。收集氯仿層，用無水NaSO4進行脫水處理，過濾后控溫45℃真空旋干，旋蒸瓶底部殘余物即為總脂肪。用氮氣吹旋蒸瓶至恒重，計算總脂肪重量。

(4)海蜇提取物中灰分的測定：將一定量的海蜇膠原蛋白提取液，放在水浴鍋上蒸干。將蒸干后的試樣先在電熱板上炭化至無煙，然后置于高溫電爐內(nèi)，控溫550℃灼燒4h，冷卻后取出放入干燥器中冷卻30min，重復(fù)燒至恒重(前后兩次稱量相差不超過0.5mg)，按公式(2)計算。

(2)

式中：m1——坩堝和灰分的質(zhì)量，g；

m2——坩堝的質(zhì)量，g；

m3——坩堝和試樣的質(zhì)量，g。

1.3.3 海蜇膠原蛋白穩(wěn)定性檢測

將海蜇膠原蛋白提取液，室溫下其質(zhì)量濃度為10mg/mL，pH值=4.0，電導(dǎo)率為1770us·cm-1，吸光度(OD220)為2.223，黏度為124mPa·S。

1.3.3．1 熱穩(wěn)定性實驗

分別將海蜇膠原蛋白提取液放置于4℃、25℃、40℃，4℃和40℃冷熱交替(每24h交替一次，持續(xù)1月)，放置結(jié)束后恢復(fù)到25℃時檢測蛋白質(zhì)溶液的電導(dǎo)率、吸光度(OD220)和黏度等指標，判斷其在不同溫度下的熱穩(wěn)定性及產(chǎn)品的儲存穩(wěn)定性，以便于推測其保質(zhì)期。

1.3.3．2 酸堿穩(wěn)定性實驗

在25℃下，通過加入醋酸溶液或NaOH溶液將海蜇膠原蛋白提取液pH值調(diào)節(jié)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，分別測定不同pH值條件下海蜇膠原蛋白提取液的電導(dǎo)率、吸光度(OD220)和黏度等各項理化指標，從而判斷其酸堿穩(wěn)定性。

1.3.4 海蜇膠原蛋白保濕霜的制備

首先水相和油相分別加熱到一定溫度并維持該溫度一段時間，然后將兩相慢慢混合到一起，一邊混合一邊以一定的速度攪拌，直至室溫變相成膏體，再用水浴加熱一段時間，在適宜的溫度下加入適量的海蜇膠原蛋白提取液和香料，再在室溫下繼續(xù)攪拌直到成膏停止攪拌。經(jīng)實驗確定海蜇膠原蛋白保濕霜的配方和最佳的工藝條件。

1.3.5 海蜇膠原蛋白保濕霜的功效檢測

1.3.5.1 干燥器法檢測定膠原蛋白保濕性能

將冰箱內(nèi)的海蜇膠原蛋白取出，在室溫下放置2h，備用。室溫下精確稱取海蜇膠原蛋白、15%甘油、大寶SOD蜜乳液各2份，每份10.0g，分別加入稱量瓶中。將一組樣品放入預(yù)先裝有飽和碳酸鈉溶液的干燥器內(nèi)(相對濕度RH=43%)，控制時間為12h、24h、48h，分別稱量放置前水分量W0，樣品控制計時后的水分量Wn，根據(jù)公式(3)計算保濕率R。，另一組樣品放入硅膠干燥器內(nèi)作為參比。

(3)

1.3.5.2 人體皮膚保濕功效測試

實驗測試條件：溫度25℃，時間2h。經(jīng)過簡單培訓(xùn)的健康大學(xué)生志愿受試者20名(男、女各10名) ，年齡22～24周歲。對受試者的要求：無系統(tǒng)性疾患史，皮膚健康受試部位皮膚無異常，未涂抹任何化妝品或外用藥物。分別在每位志愿者的左、右手臂內(nèi)側(cè)劃定區(qū)域標記受測部位(2cm ×2 cm ) ，同一手臂可同時標記多個區(qū)域(間隔1cm) ，測試樣品和空白對照均隨機分布在左、右手臂上。每個受測部位涂抹0.05 mL樣品，涂抹后采用數(shù)字皮膚水分檢測儀分別測量受試樣品區(qū)域和空白區(qū)域皮膚水分含量，每次測試隔10min。

2 結(jié)果與討論

2.1 工藝流程

海蜇膠原蛋白的提取及保濕功效研究工藝流程如圖1所示。

圖1 工藝流程示意圖

2.2 海蜇膠原蛋白提取工藝的優(yōu)化

目前膠原蛋白的提取方法主要有酸法提取、堿法提取、酶法提取和中性鹽法提取等，其中酸法浸提是海蜇膠原蛋白常用的提取方法，但是單純使用酸法浸提技術(shù)，海蜇膠原蛋白提取率并不高[4]。超聲波提取法的原理是：采用超聲波輔助溶劑，利用超聲波產(chǎn)生的高速、劇烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，使海蜇細胞破碎，使溶劑滲透到細胞中，縮短提取時間，提高提取率，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取中。因此本論文采用超聲輔助酸法提取工藝，研究了酸濃度、提取溫度、提取時間等因素對海蜇膠原蛋白提取率的影響。

2.2.1 浸提液的酸度對海蜇膠原蛋白提取率的影響

酸法浸提的原理是，在酸性條件下海蜇組織蛋白分子和Schiff堿之間的鹽鍵受到破壞，引起組織蛋白的膨脹、溶解，從而被提取出來。鹽酸、醋酸和檸檬酸溶液是常用的浸提液。本實用采用檸檬酸溶液作為浸提液，固定其他條件，單純改變浸提液中檸檬酸的濃度，考察酸濃度對海蜇膠原蛋白提取率的影響。實驗結(jié)果見圖2。

圖2 檸檬酸的濃度對海蜇膠原蛋白提取率的影響

圖2結(jié)果表明，海蜇膠原蛋白的提取率，隨著檸檬酸濃度的增加而提高。當檸檬酸濃度超過0.5mol/L后，提取率變化趨緩。考慮提取成本和后續(xù)脫酸處理等因素，最終確定浸提液的檸檬酸濃度為0.5mol/L。

2.2.2 提取溫度對海蜇膠原蛋白提取率的影響

由于海洋來源的膠原蛋白具有熱致變性的特性，當高于其熱變性溫度時，膠原蛋白的某些性質(zhì)會發(fā)生明顯改變。變性后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度降低，生物活性喪失。使用超聲波輔助提取技術(shù)，會使提取液的溫度升高。海蜇膠原蛋白為水產(chǎn)品蛋白，其熱變性溫度較低，在提取過程中如果不控制浸提液的溫度，將導(dǎo)致蛋白失去應(yīng)用價值。

固定其他條件，在不同溫度條件下，用目測法觀察膠原蛋白的變性溫度，發(fā)現(xiàn)當浸提液超過57℃時，膠體狀的溶液就會發(fā)生蛋白質(zhì)析出現(xiàn)象，這是膠原蛋白變性所導(dǎo)致的。為避免使用超聲波導(dǎo)致浸提液溫度升高，最終采用將浸提液預(yù)冷卻的方法，控制溫度不超過40℃為宜。

2.2.3 提取時間對海蜇膠原蛋白提取率的影響

固定其他條件，改變超聲波處理時間，實驗結(jié)果見圖3。

圖3 超聲處理時間對海蜇膠原蛋白提取率的影響

從圖3結(jié)果看出，超聲波處理時間過25min，海蜇膠原蛋白的提取率增加趨勢變緩，超聲波處理時間最終確定為25min。

2.2.4 海蜇膠原蛋白的性能指標

采用優(yōu)化后的提取工藝，提取得到的海蜇膠原蛋白產(chǎn)品主要指標見表1。

表1 海蜇膠原蛋白提取物主要成分指標

2.3 海蜇膠原蛋白穩(wěn)定性實驗

2.3.1 酸堿穩(wěn)定性實驗

按照1.3.3將固體物含量10%的海蜇膠原蛋白提取液，在不同pH條件下測試其電導(dǎo)率、吸光度(OD220)和黏度，結(jié)果如表2所示。

表2 海蜇膠原蛋白提取物酸堿穩(wěn)定性實驗

由表2可知，改變海蜇膠原蛋白提取液的pH值，由于離子濃度的改變導(dǎo)致電導(dǎo)率發(fā)生一些微小變化。雖然在堿性條件下，提取液的吸光度有所增大，但肉眼基本觀察不出顯著變化。綜合各項數(shù)據(jù)，表明海蜇膠原蛋白提取液在pH值=3～10范圍內(nèi)，酸堿穩(wěn)定性非常好，可以適用于各種pH條件的化妝品中。

2.3.2 熱穩(wěn)定性實驗

按照1.3.3對海蜇膠原蛋白提取液進行熱穩(wěn)定性測試，實驗結(jié)果如表3所示。

表3 海蜇膠原蛋白提取液熱穩(wěn)定性測結(jié)果

由表3可知，在海蜇膠原蛋白熱變性臨界溫度以下，電導(dǎo)率、吸光度(OD220)和黏度三項參數(shù)變化非常小，表明可在較大溫度范圍內(nèi)使用。

2.4 海蜇膠原蛋白保濕霜的基本配方

經(jīng)實驗確定的海蜇膠原蛋白保濕霜基本配方如表4所示。

表4 海蜇膠原蛋白保濕霜基本配方

表4(續(xù))

2.5 海蜇膠原蛋白保濕功能評價

2.5.1 干燥器法檢測定膠原蛋白保濕性能

以15%甘油、大寶SOD蜜乳液為參比，采用對比法，對分離提純的海蜇膠原蛋白成分進行干燥器法保濕性能試驗，試驗結(jié)果見表5。

表5 三種樣品的保濕率

結(jié)果表明，我們所提取的海蜇膠原蛋白，其保濕率優(yōu)于15%甘油和市售品牌化妝品“大寶”牌SOD蜜。

2.5.2 人體皮膚保濕功效評價

以為添加海蜇膠原蛋白的保濕霜為對照霜、市售保濕霜類著名品牌產(chǎn)品大寶SOD蜜乳液為參比，采用對比法，對所研制的海蜇膠原蛋白保濕霜樣品進行人體皮膚保濕性能試驗，結(jié)果如圖4所示。

▲-海蜇膠原蛋白保濕霜； ■-大寶SOD蜜； ▼-空白對照霜樣圖4 人體皮膚保濕功效測試

海蜇膠原蛋白保濕霜樣品經(jīng)20名受試者現(xiàn)場測試，考察其保濕效果，并與品牌產(chǎn)品進行對比試驗。結(jié)果表明，該產(chǎn)品可與名牌產(chǎn)品相媲美，其保濕效果優(yōu)于空白對照霜樣品和市售品牌化妝品"大寶"牌SOD蜜。

3 結(jié)論

研究了海蜇膠原蛋白的提取工藝，為下一步規(guī)模化提取提供了技術(shù)依據(jù)。研究了海蜇膠原蛋白提取液的穩(wěn)定性和保濕功效，實驗結(jié)果表明，所提取的海蜇膠原蛋白酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性好，具有優(yōu)良的保濕功效，其保濕效果優(yōu)于空白對照霜樣品和市售品牌化妝品“大寶”牌SOD蜜，能夠作為保濕劑添加到化妝品中。

[1]金桂芬. 海蜇膠原蛋白提取及超濾在膠原蛋白純化中的應(yīng)用[D].浙江:浙江工業(yè)大學(xué),2008.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5009. 5-2010,食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定[S].北京： 中國標準出版社，2010.

[3] Folch J,Lees M,Sloane Stanley GH. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues[J].J Biol Chem,1957,226:497-509.

[4] 莊永亮. 海蜇膠原蛋白理化性質(zhì)及其膠原肽的護膚活性研究[D].山東:中國海洋大學(xué),2009.