高溫高濕環(huán)境對(duì)Wistar大鼠生理病理的影響研究

劉詩(shī)穎，陳 杰，李賡覓，黃伍蓉，簡(jiǎn) 燚，呼永河，吳麗娟

我國(guó)西南地區(qū)氣候環(huán)境復(fù)雜，每年夏季都會(huì)出現(xiàn)持續(xù)的高溫高濕天氣，平均每年有30天日平均氣溫高于33℃，最高可達(dá)41℃以上，并且全年濕度偏高，在梅雨季節(jié)期間常常持續(xù)20天以上濕度接近100%[1]。高溫高濕環(huán)境作為一種特殊的外界因素嚴(yán)重?cái)_亂機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，導(dǎo)致重要器官如腦、心、肺、肝、腎等的功能紊亂，甚至引起衰竭并危及生命[2-4]。既往研究主要集中在討論高溫高濕環(huán)境對(duì)創(chuàng)傷[5-7]或某一特定臟器及細(xì)胞免疫功能[8-9]的影響，本研究旨在通過檢測(cè)極端高溫高濕環(huán)境下Wistar大鼠血生化及病理指標(biāo)的改變，從生理和病理的整體水平上探究高溫高濕環(huán)境急性傷害對(duì)Wistar大鼠的影響，為下步深入探討高溫高溫急性傷害的機(jī)理研究提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，170-190g，購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)scxk(川)2008-24]。在試驗(yàn)過程中，按試驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則給以實(shí)驗(yàn)鼠人道主義關(guān)懷。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器

多段編程人工氣候箱，型號(hào)RXZ-1000A，購(gòu)自中國(guó)寧波江南儀器；全自動(dòng)生化儀，型號(hào)AU5800，購(gòu)自BECKMAN公司。

2 方 法

2.1 極端高濕環(huán)境下適宜研究溫度的篩選

將人工氣候箱條件設(shè)置為RH =(95±2)%，T分別設(shè)置為(30±0.5)℃、(32±0.5)℃、(34±0.5)℃、(36±0.5)℃。將12只Wistar大鼠放入不同溫度條件的人工氣候箱中飼養(yǎng)72h，要求實(shí)驗(yàn)鼠每天置于箱內(nèi)24小時(shí)。觀察并記錄動(dòng)物死亡情況，根據(jù)死亡情況篩選適宜的研究條件。

2.2 高溫高濕環(huán)境暴露對(duì)Wistar大鼠生化和病理指標(biāo)的影響

按照“極端高濕環(huán)境下適宜研究溫度的篩選”方案，將人工氣候箱條件設(shè)置為[RH=(95±2)%，T=(34±0.5)℃]。將13只Wistar大鼠暴露于人工氣候箱中，要求實(shí)驗(yàn)鼠每天置于箱內(nèi)24小時(shí)，實(shí)時(shí)觀察記錄死亡情況，當(dāng)超過半數(shù)動(dòng)物死亡時(shí)停止實(shí)驗(yàn)，剩余存活的大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，離心收集血清進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。同時(shí)收集存活大鼠的心、肺、腎、腦、腸及肌肉組織置于4%多聚甲醛中固定，進(jìn)行病理檢測(cè)。另外，實(shí)驗(yàn)設(shè)置常溫常濕組[T=(25±0.5)℃，RH=50±2%]作為對(duì)照。

2.3 指標(biāo)測(cè)定

鉀(K)、鈉(NA)、氯(CL)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、總膽紅素(TBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、r-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、缺血修飾白蛋白(IMA)、肌酸激酶(CK)、超敏C反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)試劑盒均購(gòu)自北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司。所有指標(biāo)均在BECKMAN COULTER AU5800 全自動(dòng)生化儀上檢測(cè)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 極端高濕環(huán)境下適宜研究溫度的篩選

在極端高濕(RH=95%)條件下，Wistar大鼠暴露于30℃及32℃環(huán)境72 h未出現(xiàn)死亡；34℃條件下暴露24 h開始出現(xiàn)死亡，且死亡率隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，暴露72 h后死亡率達(dá)到83%，顯著高于30℃和32℃組(P<0. 05)；36℃條件下暴露12 h死亡率突然躍升到92%，72 h時(shí)死亡率已經(jīng)達(dá)到100%，顯著高于30℃和32℃組(P<0. 05)，而與34℃組無(wú)顯著性差異(P>0. 05)。

*與30℃和32℃組比，P<0. 05

3.2 高溫高濕環(huán)境對(duì)Wistar大鼠血生化指標(biāo)的影響

將13只Wistar大鼠暴露于[RH=(95±2)% / T=(34±0.5)℃]環(huán)境中，到46 h時(shí)死亡7只，取剩余6只存活大鼠血液進(jìn)行生化指標(biāo)的檢測(cè)(見表1)。生化結(jié)果顯示，與常溫常濕對(duì)照組相比，高溫高濕環(huán)境下暴露46 h后Wistar大鼠血鉀(K+)和缺血修飾白蛋白(IMA)水平均顯著降低(P<0. 05)，而總膽紅素(TBIL) 和肌酐(CREA)水平均顯著升高(P<0. 05)，其它生化指標(biāo)無(wú)顯著差異(P>0. 05)。

表1 Wistar大鼠生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

3.3 高溫高濕環(huán)境對(duì)Wistar大鼠病理指標(biāo)的影響

Wistar大鼠在高溫高濕環(huán)境[RH=(95±2)% /T=(34±0.5)℃]中暴露46h后，解剖發(fā)現(xiàn)大多數(shù)死亡動(dòng)物存在肺部充血、胃腸腫脹、肝臟淤腫現(xiàn)象(見圖2)。經(jīng)病理檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)心臟組織心肌間質(zhì)水腫，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分心肌細(xì)胞發(fā)生退變，肌纖維溶解；肺組織間質(zhì)結(jié)構(gòu)增寬，間質(zhì)內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腎組織間質(zhì)出血明顯；腸組織在粘膜層可見嗜酸性粒細(xì)胞和大量漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫、出血；而腦和肌肉組織均未見明顯病理學(xué)改變(見圖3)。

A：心；B：肺；C：腎；D：腦；E：腸；F：肌肉；G：脾；H：肝

A：高溫高濕組；B：常溫常濕組；

4 討 論

高溫高濕環(huán)境會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生不良影響，其根本原因是環(huán)境溫度超過了體表溫度，導(dǎo)致機(jī)體不僅無(wú)法進(jìn)行正常的散熱，還會(huì)從熱環(huán)境中獲得能量使人體免疫功能減退，同時(shí)大量水汽使體表汗液蒸發(fā)困難，加重機(jī)體對(duì)溫度的敏感性。

有研究發(fā)現(xiàn)[10]，當(dāng)環(huán)境溫度大于30℃時(shí)，相對(duì)濕度每增加10%，對(duì)機(jī)體帶來的熱影響，相當(dāng)于環(huán)境溫度增加1～1.5℃。30℃的環(huán)境溫度便可使安靜狀態(tài)下的人體體溫升高，35℃時(shí)這種影響非常顯著，故認(rèn)為高濕度對(duì)生理產(chǎn)生不良影響的溫度界限是35℃。本研究發(fā)現(xiàn)在高濕環(huán)境中(RH=95%)，30℃和32℃的研究溫度作用過于溫和，36℃作用過于猛烈，均不適宜開展高溫高濕急性傷害研究；34℃的研究溫度既能在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大鼠造成損傷，死亡又不會(huì)過于迅速，便于采集標(biāo)本，因此本研究選擇[RH=(95±2)% /T=(34±0.5)℃]的實(shí)驗(yàn)條件較為合適。

本研究發(fā)現(xiàn)濕熱環(huán)境暴露46h后K+離子濃度顯著下降，這可能是由于在高溫高濕環(huán)境下大鼠呼吸頻率加快，血中CO2的排出量增多，血液中H+、HCO3-濃度下降，pH值升高，為了保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，機(jī)體通過泌尿作用排出Na+、K+等堿性離子，而伴隨著血漿滲透壓下降和動(dòng)物大量飲水，醛固酮的保鈉排鉀作用使K+濃度進(jìn)一步下降，Na+濃度總體變化不大。血肌酐的濃度變化主要由腎小球的濾過能力來決定，我們推測(cè)高溫高濕環(huán)境暴露可能對(duì)腎臟造成了損傷使濾過率下降，導(dǎo)致血肌酐濃度顯著升高，在病理檢測(cè)中我們也發(fā)現(xiàn)腎臟出現(xiàn)了明顯的間質(zhì)出血現(xiàn)象。同樣，總膽紅素水平的升高也提示了高溫高濕環(huán)境對(duì)肝臟的傷害。缺血修飾白蛋白(IschemiaModifiedAlbumin，IMA)是指示心肌缺血的靈敏指標(biāo)，IMA的形成與血液中游離的Cu2+含量有關(guān)，在濕熱環(huán)境中血液PH值升高，導(dǎo)致Cu2+無(wú)法從循環(huán)蛋白的金屬結(jié)合位點(diǎn)釋放，從而阻礙了IMA的生成，同時(shí)熱應(yīng)激還能誘發(fā)釋放多種內(nèi)源性活性物質(zhì)抵抗心肌缺血損傷[11]，如腺苷[12]、一氧化氮[13]等。

研究還發(fā)現(xiàn)高溫高濕環(huán)境暴露46h后心臟、肺及腸道存在明顯的炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，我們推測(cè)這可能是由于濕熱環(huán)境暴露導(dǎo)致全身血流重新分配，胃腸道血流量下降，使其發(fā)生缺血缺氧性損害，最終造成腸道屏障作用減弱，通透性增加，致使腸道內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素能夠自由地進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，移位至血液內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素可以激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞、中性細(xì)胞分泌活性細(xì)胞因子如TNF-α，TNF-α可以刺激其他細(xì)胞因子如IL-4，IL-6等的釋放，擴(kuò)大其生物學(xué)效應(yīng)，介導(dǎo)出現(xiàn)全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，進(jìn)而引起多器官功能障礙綜合征(MODS)[14]。

多數(shù)研究者認(rèn)為發(fā)生熱應(yīng)激時(shí)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，使細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，膜結(jié)構(gòu)遭到破壞導(dǎo)致其通透性增高，各組織細(xì)胞分泌的酶釋放進(jìn)入血液，成為細(xì)胞受損的標(biāo)志物。然而本研究中包括CK、ALT、AST等在內(nèi)的酶類并沒有顯著性的改變，與韓喜彬[15]等的研究結(jié)果相差較大，這可能是由于溫濕度差異或者熱暴露時(shí)間的不同引起的，不同的溫度也可以直接影響酶的含量或活性。這說明我們的研究還存在有待完善的地方，接下來的研究中我們希望通過延長(zhǎng)環(huán)境暴露時(shí)間并動(dòng)態(tài)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)大鼠血生化和病理指標(biāo)的改變，找到變化最顯著的時(shí)間點(diǎn)，更進(jìn)一步地從轉(zhuǎn)錄組水平探討高溫高濕急性傷害的分子機(jī)制，從而為高溫高濕急性傷害研究奠定理論基礎(chǔ)。

[1]鄭敏，翁廟成，劉方，等．高溫高濕環(huán)境對(duì)家兔血液流變特性與生化指標(biāo)的影響[J]．中南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，43(7): 2883-2888．

[2]李國(guó)建．高溫高濕低氧環(huán)境下人體熱耐受性研究[D]．天津大學(xué)，2008: 2-5．

[3]岳海燕，申雙和．呼吸道和心腦血管疾病與氣象條件關(guān)系的研究進(jìn)展[J]．氣象與環(huán)境學(xué)報(bào)，2009，25(2): 57-61．

[4]李慶濱，盛麗，何燕，等．氣象因素對(duì)急性心肌梗死發(fā)病的影響及因時(shí)護(hù)理措施[J]．中華護(hù)理雜志，1997，32(11): 621-624．

[5]馬曉東，李揚(yáng)，梁永平．高溫高濕環(huán)境對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦水腫的影響[J]．軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33(1): 66-70．

[6]郭燕舞，張世忠，朱紅勝，等．高溫高濕環(huán)境下顱腦損傷動(dòng)物創(chuàng)腔及周圍組織細(xì)菌生長(zhǎng)的特點(diǎn)[J]．中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10(12): 187-189．

[7]裴國(guó)獻(xiàn)．重視熱帶地區(qū)戰(zhàn)創(chuàng)傷救治研究[J]．解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2003，28(4): 285-288．

[8]汪曉．高溫高濕條件下運(yùn)動(dòng)致大鼠多臟器損傷及其機(jī)制研究[D]．福建醫(yī)科大學(xué)，2013: 23-28．

[9]SHEPHARDRJ,SHEKPN.Immunedysfunctionasafactorinheatillness[J].CritRevImmunol, 1999, 19(4): 285-302.

[10]于永中，李天麟，劉尊永，等．高溫環(huán)境中濕度的某些生理作用[J]．中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，1984，(1): 31-33.

[11]陶衛(wèi)國(guó)．熱應(yīng)激對(duì)心肌缺血耐受性影響的機(jī)制[J]．心臟雜志，2004，16(4): 384-386．

[12]RICHARDV,LAUDEK,ARTIGUESC.Heatstressincreasesendothelium-dependentrelaxationsandpreventsreperfusion-inducedendothelialdysfunction[J].ClinExpPharmacolPhysiol, 2002, 29(11): 956-962.

[13]JOYEUXM,ARNAUDC,GODIN-RIBUOTD.Endocannabinoidsareimplicatedintheinfarctsize-reducingeffectconferredbyheatstresspreconditioninginisolatedrathearts[J].CardiovascRes, 2002, 55(3): 619-625.

[14]LIUZ.,SUNX,TANGJ,etal.Intestinalinflammationandtissueinjuryinresponsetoheatstressandcoolingtreatmentinmice[J].MolMedRep, 2011, 4(3): 437-443.

[15]韓喜彬，巴彩鳳．SD大鼠熱應(yīng)激模型的制作及平價(jià)[J]．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30(17): 31-34．