聲帶黏膜組織工程的研究進展

何長頂 邵駿

聲帶從組織學上可分為3層結構：上皮層、固有層和肌肉層。上皮層為黏膜上皮,主要由鱗狀細胞組成，作用是保護深層組織；聲帶固有層是聲帶發(fā)音中聯(lián)系最密切的組織結構，是位于上皮層和肌層之間柔軟的結締組織，固有層又可分為淺固有層、中固有層和深固有層[1]；固有層深面為甲杓肌。聲帶上皮及淺表層構成聲帶的包膜部(cover)，而深層及聲帶肌合稱為聲帶本體部(body)[2-3]。聲帶黏膜在發(fā)聲期間呈波浪形運動，這種力學特性主要依賴于聲帶組織特殊的結構。很多常見刺激可以導致聲帶功能紊亂和損害，包括過度發(fā)聲、化學暴露(如吸入煙霧)、胃食管反流、過敏、插管、外傷、放射性炎癥等。良性的聲帶損傷通常局限在淺固有層，通過禁聲和言語訓練可以暫時緩解，但有些病變則需要手術治療解決，如聲帶小結和聲帶息肉。手術或其他醫(yī)源性損傷可能導致聲帶正常組織纖維化[4]。聲帶瘢痕的形成會破壞聲帶黏膜的層次結構，降低固有層的柔軟性、損害發(fā)聲，并且會造成聲帶黏膜黏彈性的改變和聲帶的不規(guī)則振動，最終引起聲嘶。聲帶瘢痕對耳鼻喉科醫(yī)師來說仍然是個挑戰(zhàn)，因為如今仍缺乏有效的療法。到目前為止，聲帶瘢痕的治療方法主要包括，喉成形術、激光療法、瘢痕減壓切開術、上皮下筋膜移植等。雖然部分患者經(jīng)上述治療后，聲音質量有所改善，但很難恢復到正常水平。而另一種正在研究的細胞注射療法很有希望減輕瘢痕的影響，但可能不足以修復大的瘢痕，容易被吸收，需要重復注射。所以對于聲帶瘢痕可能有效的治療方法是取代聲帶黏膜的組織工程技術。本文就聲帶黏膜組織工程技術的研究進展進行綜述。

1 組織工程概述

組織工程學是結合工程學和生命科學，在體外或體內(nèi)構建組織或器官的新興學科。原理是以少量種子細胞經(jīng)體外擴增后與生物材料、細胞因子結合，修復較大的組織或器官缺損，重建其生理功能，達到完美的形態(tài)甚至功能修復是其最終目標。根據(jù)組織工程學原理，組織或者器官的重建主要包括3個要素：種子細胞、支架材料和生物活性因子。這3種成分要求能自我裝配成有組織、有功能的結構，并且不會和個體發(fā)生排斥反應[5]。組織工程目前的程序主要包括分離和提純用于移植的細胞，將細胞與生物材料相結合，以及制作以生物材料為基礎的網(wǎng)架和生物活性分子的管理[5]。在臨床上，生物材料、生長因子和信號蛋白的應用已經(jīng)成為現(xiàn)實，這也使人類器官的修復和重生成為可能。構建類似于聲帶固有層和上皮層的三維(3D)細胞群基質，在切除聲帶瘢痕后, 用新的有組織結構的細胞外基質和上皮作為替代物, 從而改善聲帶的振動功能。因此聲帶的組織工程技術包括生物網(wǎng)架、種子細胞和生物活性因子3個重要方面。Yamaguchi等[6]報道了在3D膠原凝膠基質中重建喉黏膜，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞和氣液面的處理對培養(yǎng)的上皮細胞增殖和分化產(chǎn)生很大影響。近些年，許多聲帶黏膜的組織工程已經(jīng)嘗試使用脫細胞化的細胞外基質、膠原蛋白和纖維蛋白網(wǎng)架，并植入多能干細胞及其衍生物或體細胞。這些技術已經(jīng)可以生產(chǎn)出所需要組織結構的黏膜[7]。

2 種子細胞

應用于組織工程的細胞常常以它們的來源分類，如同種異體細胞、自體細胞和異種細胞。如今，常用的種子細胞包括脂肪細胞源干細胞、人類聲帶纖維原細胞(vocal fold fibroblasts, VFFs)和上皮細胞、口腔黏膜細胞等。這些種子細胞所制成的組織工程聲帶黏膜已經(jīng)具備近似天然聲帶組織的形態(tài)學特點。如Ling等[8]分離了人類聲帶纖維原細胞和上皮細胞，經(jīng)過培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)生物工程黏膜顯示出天然組織的形態(tài)學特點，包括黏膜形態(tài)的蛋白質組、復雜性細胞外基質與黏膜基本屏障功能的形成，這與天然組織十分相似。當移植到犬的聲帶上時(體外)，這種黏膜可以產(chǎn)生振動并輸出聲音，這些生理現(xiàn)象和自身組織所產(chǎn)生的很難區(qū)分；當移植到人源化的鼠身上時，這種黏膜可以存活并且被人類適應性免疫系統(tǒng)所耐受。Fukahori等[4]選擇獵犬自體的口腔黏膜細胞作為種子細胞，用組織工程技術重生聲帶黏膜。Shiba等[9]將兔間充質細胞分離并培養(yǎng)在纖維蛋白水凝膠中，制成組織工程聲帶黏膜，然后移植到兔聲帶上，4周后切除兔聲帶并進行發(fā)音和組織學檢測，最終在移植點上發(fā)現(xiàn)了黏膜波，證明實現(xiàn)了發(fā)音功能。而組織學顯示重吸收的纖維蛋白基質、連續(xù)的上皮細胞和輕微增加的膠原蛋白與對側未手術聲帶相似。組織工程聲帶黏膜成功地被移植到8只兔上，并且很少出現(xiàn)瘢痕形成及免疫反應。另外，其他常用的種子細胞還有人類胚胎干細胞[10]、骨髓來源間充質干細胞[11]，也取得很好的效果。

3 生物網(wǎng)架

恢復組織結構功能是組織工程的一個重要原則。研究者只有復制正常組織的結構才可能實現(xiàn)預期的功能。種子細胞的生長需要微環(huán)境，體內(nèi)組織特異性微環(huán)境決定了組織細胞的分化、成熟。然而在體外復制合成聲帶固有層細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的膠原蛋白、纖維蛋白、透明質酸和各種輔助蛋白，以目前的技術很難完成，所以現(xiàn)在的方法只能在臨時網(wǎng)架中復制一些關鍵要素，這種網(wǎng)架經(jīng)過改進后在體外可以被植入細胞吸收或者在體內(nèi)被宿主細胞吸收。支架材料可分為2大類：一是合成的，如人造聚合物和凝膠；二是天然來源的，如細胞外基質、膠原蛋白和多糖。在以生物支架為基礎的聲帶組織工程中，已經(jīng)有一些比較成功的臨床應用，如脫細胞器官基質、生物高分子聚合物、人工合成水凝膠和人工合成高分子聚合物制成的3D網(wǎng)架[12]。

制作脫細胞器官基質需要先移除所有活細胞和可溶性分子，分離出不含有抗原性物質的膠原支架，因此適合不同個體甚至不同物種間的移植。目前來源于脫細胞基質的生物支架材料已經(jīng)成功在組織工程中應用[11, 13]。如Xu等[14]描述了一種異基因脫細胞ECM網(wǎng)架。制作過程主要是將牛聲帶固有層標本經(jīng)過高濃度氯化鈉、核酸分解和乙醇脫水處理，達到脫細胞化并且移除免疫原性抗原表位，再將初代培養(yǎng)人VFFs種植到非細胞網(wǎng)架中培養(yǎng)。初步結果顯示，這種非細胞ECM支架可以產(chǎn)出有完整基底膜和3D結構的基質蛋白，聲帶纖維原細胞可以穩(wěn)定地黏附并滲透這種網(wǎng)架，并有著高度的生存能力和活躍的蛋白合成能力。生物高分子聚合物中的膠原蛋白因為其生理特性和比較好的生物相容性，常應用于組織工程的研究，并且可以被制成水凝膠形式。雖然膠原蛋白可以單獨用在纖維原細胞的3D培養(yǎng)中，但是這種重組的膠原凝膠機械強度比較低，容易被迅速降解。膠原蛋白與其他物質的混合物現(xiàn)在也比較多見，經(jīng)常被用到聲帶黏膜的組織工程中[15]。如Ling等[8]將經(jīng)提純的原代細胞培養(yǎng)在聚合Ⅰ型膠原蛋白中，而Fukahori等[4]也是以Ⅰ型膠原蛋白凝膠作為網(wǎng)架。此外透明質酸研究也較為廣泛，因為其不能獨自構建3D結構，所以到目前為止在組織工程中常被改性成共聚物。如Farran等[16]將膠原蛋白和透明質酸衍生物(HACHO和HAADH)進行合成，產(chǎn)生2種類型的水凝膠。第1種水凝膠含有通過HACHO穩(wěn)定的成熟膠原纖維，第2種含有無定性基質穿插固定的不成熟膠原纖維。植入這2種水凝膠的VFFs可以表達多種ECM蛋白，而且這種膠原蛋白-透明質酸合成的水凝膠可以延長VFFs的3D培養(yǎng)時間。

人工合成網(wǎng)架可以提供更多的調(diào)控和再生性。由于人造網(wǎng)架缺乏生物基質的內(nèi)在復雜性，植入細胞仍需要外加的信號分子指導它們的行為。近些年，關于模仿彈性纖維二級結構生物可降解嵌段共聚物的研究較多，如可降解聚氨酯[17](PURs)和聚乙二醇(PEG)。相比非降解性移植物，這些生物材料可以在活體內(nèi)降解，而且可以促進新組織的再生。針對聲帶組織工程的研究，Liao等[18]研究功能材料的參數(shù)(如篩孔大小、力學性質、生物活性和降解速率)對細胞反應和黏膜柔韌性的作用，他們采用以PEG為基礎的水凝膠(PEG30)制成網(wǎng)架(可以通過改變組成來控制其結構)，從而控制其機械力學性能、細胞表達以及基質重塑，結果表明篩孔大小對膠原沉積非常重要。Karajanagi等[19]研究了PEG30在體內(nèi)的生物兼容性，首先在犬的聲帶注射PEG30水凝膠，隨后使用高速攝影記錄聲帶的振動和發(fā)音功能，通過磁共振成像和組織學染色進行3D結構分析。結果顯示PEG30對正常的發(fā)音功能沒有影響。Kwon等[20]選用聚己酸內(nèi)酯(PCL)和普朗尼克F127為合成材料，內(nèi)窺鏡和組織學分析顯示這種PCL/普朗尼克127凝膠混合物與周圍環(huán)境融合良好，沒有炎癥反應，是治療聲帶麻痹很有前景的生物材料。其他可以用于聲帶組織工程的生物材料，如聚醚聚氨酯(PEUs)是一種可滲透、可調(diào)節(jié)的生物材料，來源廣泛且價格便宜。研究顯示高密度、高質量濃度的PEU框架非常適合模擬活體內(nèi)聲帶組織的黏彈性[21]。

4 生物活性因子

生長因子是控制細胞增殖和分化的肽分子，可以調(diào)控細胞增殖、分化、基因表達，是組織工程學構建不可缺少的關鍵因素，所以在臨床上廣泛研究。其中堿性纖維蛋白原生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)對于聲帶組織工程尤為重要。Hirano[22]等首次使用bFGF治療人類萎縮的聲帶，結果表現(xiàn)為空氣動力學和發(fā)聲參數(shù)提高。他們還發(fā)現(xiàn)在年老的老鼠中，bFGF顯著增加了透明質酸纖維原細胞產(chǎn)物，減少了膠原蛋白的沉積。已有研究[23]表明，透明質酸的增加與瘢痕減少有關，高水平的透明質酸對聲帶的無瘢痕愈合有幫助。Luo等[24]的研究顯示，多種生長因子對聲帶組織細胞-水凝膠結構的組成有作用,如轉化生長因子-β1(TGF-β1)、bFGF和HGF等，其中HGF可以有效刺激透明質酸和彈性蛋白的產(chǎn)生，抑制膠原蛋白的合成。

5 生物反應器

由于聲帶組織處于一種特殊的環(huán)境中，生長在聲帶組織中的細胞對振動和漸變力高度敏感。這和來自其他組織中的纖維細胞不同，聲帶的成熟依賴發(fā)聲來源的機械刺激和激素信號。有研究[6, 25-26]表明，由聲帶振動產(chǎn)生的力傳導可能是成人聲帶黏膜EMC和分層結構形成的重要因素。近些年的研究目標是開發(fā)一種體外模擬人類聲帶的機械環(huán)境。Titze等[27]研究了短期拉伸應變對聲帶成纖維細胞的作用，將已種植種子細胞的基質放于生物反應器中，以20～200 Hz頻率振動，結果顯示培養(yǎng)細胞的彈性蛋白、前膠原蛋白纖連蛋白mRNA表達增強。 Wolchok等[28]的研究證實，與聲帶振動類似的刺激可以影響到幾種關鍵基質和基質相關基因的表達，并且增加ECM蛋白、纖連蛋白和膠原蛋白的積累。所以聲帶的組織工程需要特殊的生物反應器，用來模仿聲帶組織所處的機械環(huán)境。Zerdoum等[29]設計了一種生物反應器，可以通過空氣振動產(chǎn)生振動性刺激，克服了機械驅動振動裝置的慣性問題，可以將揚聲器產(chǎn)生的振動信號轉化為空氣振動形式。這種新型的生物反應器使用簡單、方便，而且細胞培養(yǎng)表現(xiàn)出較高活力和復制能力。但現(xiàn)在的設備也有一些自身局限性，如振動幅度比正常聲帶組織小、不能模擬正常發(fā)聲時聲帶的雙邊碰撞等?；蛘咴谀M發(fā)音的生物力學刺激下，可能會造成網(wǎng)架結構的破碎，所以也促使研究者尋求更有韌性的網(wǎng)架材料[30]。生物反應器作為一種研究細胞反應的方式對于評價聲帶組織重建的意義重大。

6 應用研究情況及前景

目前已經(jīng)有了一些組織工程聲帶黏膜比較成功的實驗研究。如Long等[31]把兔脂肪來源的間充質干細胞種植在3D纖維蛋白凝膠網(wǎng)架中，制作成一種組織工程聲帶黏膜；然后將16只行單側聲帶上皮和固有層切除的兔，分別用重新移植已切除的聲帶黏膜層和移植制作的組織工程聲帶黏膜2種方法進行治療；4周后對聲帶進行組織結構和發(fā)音功能檢測。高速攝影顯示2種治療方式后的聲帶振動相似，閉合良好；而組織學檢測顯示組織工程聲帶黏膜層表現(xiàn)出更接近天然的特性。Fukahori等[4]選擇獵犬自體口腔黏膜細胞作為種子細胞制作組織工程聲帶黏膜，然后將其移植到犬黏膜缺損的聲帶上。2個月后觀察聲帶振動和形態(tài)學特點，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的組織工程聲帶黏膜分成復層上皮和固有層，這和正常人分層的聲帶黏膜十分相似。頻閃喉鏡顯示在移植處有規(guī)律但微弱的黏膜波產(chǎn)生，移植物存活狀態(tài)良好，并且和周圍組織沒有明顯的界線。

綜上所述，人類聲帶獨特的力學特性導致其很容易受到損傷，從而引起聲損害和瘢痕形成。聲帶黏膜的組織工程有著廣闊的應用前景，不僅對聲帶黏膜急性損傷(如外傷和喉癌術后)的修復效果比較好[32]，而且對于聲帶瘢痕的形成和治療也有明顯的作用[33]。目前各種技術制作的生物支架已經(jīng)取得了一些令人激動的進步，然而組織工程學聲帶到目前為止仍不能實現(xiàn)如天然聲帶般復雜并且多層次結構、空氣動力到聲音的能量轉換和高頻振動等功能。目前的多數(shù)研究只集中在單個方面，如只研究種子細胞或者生物支架材料。更長遠的研究應該將可降解的網(wǎng)架結構、種子細胞的移植、可溶性生長因子的釋放和動態(tài)的機械刺激相結合，才有可能實現(xiàn)協(xié)同效果。

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