HIV-1表型耐藥檢測(cè)方法研究進(jìn)展

李育芬 廖斌 馮瑞琳 劉芳芳

（昆明市疾病預(yù)防控制中心 云南 昆明 650228）

采用HIV耐藥檢測(cè)了解患者的HIV耐藥性，對(duì)治療艾滋病患者和控制疫情十分重要。常用檢測(cè)方法有基因型和表型耐藥檢測(cè)，基因型耐藥檢測(cè)是間接法，針對(duì)已被證實(shí)的突變位點(diǎn)，不能發(fā)現(xiàn)潛在的耐藥突變點(diǎn)，不能解釋多種耐藥突變位點(diǎn)的協(xié)同吉抗效應(yīng)。表型耐藥檢測(cè)可克服其不足，準(zhǔn)確檢測(cè)HIV病毒的耐藥性。本文對(duì)HIV-1表型耐藥檢測(cè)方法學(xué)進(jìn)展作一綜述。

1.HIV-1表型耐藥檢測(cè)原理

美國(guó)食品和藥品管理局批準(zhǔn)用于HIV抗病毒治療藥物分三類：蛋白酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和融合抑制劑。HIV表型耐藥檢測(cè)就是針對(duì)這些藥物而進(jìn)行。

表型耐藥檢測(cè)是病毒耐藥性分析的標(biāo)準(zhǔn)方法，運(yùn)用體外藥敏分析法，在逐漸增加藥物濃度下對(duì)HIV復(fù)制能力直接評(píng)價(jià)。結(jié)果以50%抑制濃度（IC50）來(lái)表達(dá)，并與同類野生株的IC50或臨界值（CUT-OFF值）相比，通過(guò)其倍數(shù)改變?cè)u(píng)價(jià)耐藥程度[1]。

2.常用的HIV-1表型耐藥檢測(cè)方法

2.1 傳統(tǒng)表型耐藥檢測(cè)方法（即標(biāo)準(zhǔn)表型檢測(cè)）

其實(shí)質(zhì)是體外藥敏試驗(yàn)，從病人體內(nèi)分離外周血單核淋巴細(xì)胞（PBMC），與植物血凝素（PHA）刺激正常人的PBMC共培養(yǎng)，分離出病毒株并計(jì)算其50%組織培養(yǎng)感染計(jì)量（TCID50），用一定的病毒量（1000 TCID50）體外感染PHA活化的正常人PBMC，在梯度稀釋的藥物濃度下孵育病毒，7天后用ELISA法檢測(cè)上清液中P24抗原量，以此計(jì)算IC50，與野生株IC50或cut-off值進(jìn)行比較得出病毒株的耐藥程度[2]。該法檢測(cè)的病毒是通過(guò)分離培養(yǎng)患者PBMC獲得，不是直接來(lái)自患者血漿的病毒。但前者中的HIV-1耐藥突變遲于后者。

2.2 C8166-R5細(xì)胞替代PHA活化PBMC的表型耐藥檢測(cè)Krowick H等人通過(guò)對(duì)10種細(xì)胞系表達(dá)CD4受體、CCR5、CXCR4輔助受體的能力、HIV感染力及耐藥檢測(cè)分析等方面的研究，認(rèn)為C8166-R5細(xì)胞具備替代PHA活化PBMC用于表型耐藥檢測(cè)的效果，有很好的治療效果預(yù)此種培養(yǎng)增殖周期短（倍增時(shí)間＜16h），易于長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)[3]。

2.3 用改造的細(xì)胞進(jìn)行表型耐藥檢測(cè)

2.3.1 早期構(gòu)建的HeLa/CD4+細(xì)胞表型耐藥檢測(cè) 在1988年，Chsebro等構(gòu)建了HeLa/CD4+細(xì)胞用來(lái)定量檢測(cè)HIV-1，隨后進(jìn)行表型耐藥檢測(cè)。該法簡(jiǎn)單但缺少CCR5輔助受體，僅適用于T嗜性CXCR4 HIV-1的檢測(cè)[4]。

2.3.2 對(duì)兩種輔助受體的HIV-1進(jìn)行表型耐藥檢測(cè) AStuko Hachiya等將用來(lái)做空斑減數(shù)實(shí)驗(yàn)的Hela∕CD4+進(jìn)行改造篩選產(chǎn)生了MACIC-5細(xì)胞，其穩(wěn)定表達(dá)CD4+、CXCR、CCR5并包含整合的β-半乳糖苷基因，通過(guò)藍(lán)斑形成單位（BFU）的降低反映藥物的抑制活性，根據(jù)BFU降低的百分?jǐn)?shù)與藥物濃度可計(jì)算出藥物對(duì)病毒的IC50[6]。該法快速簡(jiǎn)單，只需血漿標(biāo)本病毒載量＞10000拷貝/mL2周可得到結(jié)果（傳統(tǒng)方法需一個(gè)月左右）。

2.3.3 “All-in-one Assay”的表型檢測(cè)方法 Atsuko Hachiya在建立了基于MAGICS細(xì)胞檢測(cè)法后，2003年發(fā)展了“All-in-one Assay”表型檢測(cè)方法。該法能檢測(cè)病毒在體內(nèi)藥物濃度下的藥物敏感性結(jié)果。使針對(duì)每個(gè)個(gè)體特異的表型檢測(cè)成為可能。

2.4 使用重組病毒HIV表型耐藥檢測(cè)方法

此類方法目前應(yīng)用最廣泛。其原理是將反轉(zhuǎn)錄-PCR擴(kuò)增的患者體內(nèi)基因插入載體中，通過(guò)重組病毒進(jìn)行表型耐藥檢測(cè)。即把逆轉(zhuǎn)錄—PCR擴(kuò)增的患者HIV-1蛋白酶（PR）和逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）區(qū)基因插入載體中，通過(guò)產(chǎn)生的重組病毒進(jìn)行表型耐藥檢測(cè)。其耐藥表型是測(cè)定藥物對(duì)病毒的50%抑制濃度（IC50），分析與野毒株之間IC50相差倍數(shù)，5～10倍以上為耐藥陽(yáng)性。

2.4.1 同時(shí)針對(duì)HIV蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶抑制劑的定量表型耐藥檢測(cè)方法。Jan weber等人設(shè)計(jì)的該方法將患者來(lái)源的HIVp2-INT(gag-p2/NCp7/pl/p6/pol-PR/RT/IN)基因序列以一個(gè)片段（3428bp）或兩個(gè)重疊片段（I657bp和2002bp）的形式PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物整合到pRECnfl-TRR-P2-INT/URA3載體上。該載體幾乎包含整個(gè)HIV-1基因組，只是用酵母菌的尿嘧啶合成基因（URA3）代替3428bp的p2-INT片段?？稍u(píng)估新抗病毒藥物及多種治療方法失敗的患者的耐藥。

2.4.2 改造的重組病毒表型測(cè)定法 美國(guó)Virologic公司Petropoulos等人， 1999年對(duì)重組病毒表型測(cè)定法進(jìn)行改造。利用耐藥檢測(cè)載體（RTVs）來(lái)測(cè)定樣本對(duì)PR和RT抑制劑的敏感性，該載體包含一個(gè)熒光素激發(fā)報(bào)告基因和從病人血漿中提取擴(kuò)增的HIV-1PR和RT序列。通過(guò)將RTVs與一表達(dá)細(xì)胞內(nèi)小鼠白血病病毒4070A的env的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞，然后在不同藥物作用下培養(yǎng)重組病毒，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因來(lái)判斷重組病毒的復(fù)制能力。該法高通量且8～10天完成?？捎糜谥委熓≌咝轮委熕幬锏倪x擇及感染耐藥毒株者初治方案的擬定。

2.4.3 單細(xì)胞水平表型測(cè)定法 治療過(guò)程中 HIV在病人體內(nèi)發(fā)展為耐藥毒株，繼續(xù)原治療方案用藥原因有：耐藥毒株對(duì)藥物組合還有部分敏感性，對(duì)一種藥物敏感性降低并不干擾其他藥物的抗病毒活性；其次耐藥突變的病毒比敏感的野生毒株的復(fù)制適應(yīng)性要差很多。Zhang等2004年建立了一種新的單細(xì)胞水平表型測(cè)定法，可對(duì)殘余藥物敏感性和復(fù)制能力降低的耐藥毒株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定?？蓪?duì)臨床治療失敗的用藥方案提供依據(jù)。

2.5 用快速生化反應(yīng)檢測(cè)藥物敏感性的表型檢測(cè)法

Ganla-Lema和Heneine建立了非細(xì)胞依賴型耐藥檢測(cè)法，利用生化法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶活性的檢測(cè)進(jìn)行HIV-1表型耐藥分析。該法無(wú)需分離培養(yǎng)病毒1～2天內(nèi)得到結(jié)果且對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求低，提高檢測(cè)可重復(fù)性并降低成本。

2.6 虛擬表型耐藥檢測(cè)

“虛擬”表型由美國(guó)強(qiáng)生Virco BVBA公司研發(fā)，把基因突變框架與已知的數(shù)據(jù)庫(kù)中成對(duì)基因型和表型進(jìn)行比對(duì)得到預(yù)測(cè)表型結(jié)果。該技術(shù)依托于已有的HIV蛋白酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列以及相應(yīng)表型結(jié)果，根據(jù)患者HIVDNA或RNA序列的耐藥突變，對(duì)耐藥程度的表現(xiàn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。此技術(shù)與表型檢測(cè)相比耗時(shí)少（1～2周），價(jià)格低，結(jié)果直觀。

3.表型耐藥檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

HIV表型耐藥檢測(cè)在逐步增加的藥物濃度下，體外直接觀察病毒的生長(zhǎng)情況。

3.1 直接檢測(cè)病毒對(duì)藥物的敏感性

基因型檢測(cè)法建立在已知的耐藥突變位點(diǎn)與藥物耐受關(guān)系的基礎(chǔ)上，對(duì)于這些區(qū)域外及這些區(qū)域內(nèi)的非典型突變?；蛐湍退帣z測(cè)系統(tǒng)內(nèi)未提及，可能遺漏，影響最終結(jié)果[7]。表型檢測(cè)方法卻能檢測(cè)出。

3.2 基因型檢測(cè)結(jié)果須用解釋系統(tǒng)才能預(yù)測(cè)病毒的耐藥性有時(shí)不能正確解釋多個(gè)突變位點(diǎn)之間的協(xié)同，吉抗效應(yīng)；而HIV表型耐藥檢測(cè)所有突變的凈作用，結(jié)果易于解釋。

3.3 表型耐藥檢測(cè)方法不受病毒亞型影響

基因突變位點(diǎn)推測(cè)耐藥性的解釋系統(tǒng)主要針對(duì)B亞型[5]。

3.4 可對(duì)HIV-1耐藥情況進(jìn)行定量測(cè)量。可評(píng)估任何抗病毒藥物。

4.HIV-1表型耐藥檢測(cè)的局限性

大多數(shù)HIV表型耐藥檢測(cè)方法需培養(yǎng)病毒，有局限性。

4.1 需生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室 易受環(huán)境因素，細(xì)胞、病毒狀態(tài)，操作人員的人為因素等影響，重復(fù)性較差費(fèi)用高。

4.2 耐藥性檢測(cè)周期長(zhǎng) 雖然重組病毒檢測(cè)在簡(jiǎn)化了步驟，但未明顯地降低檢測(cè)周期。

4.3 未對(duì)所有藥物制定cut-off值，未確定表型檢測(cè)之間的標(biāo)準(zhǔn)。

4.4 檢測(cè)病毒對(duì)單個(gè)抗病毒藥物的敏感性，不反映多個(gè)抗病毒藥物之間的吉抗和協(xié)同作用。

4.5 通常不能檢測(cè)出突變的病毒株比例較低耐藥株。病毒載量＜1000copies/mL時(shí)，不易得到檢測(cè)結(jié)果。

5.HIV-1表型耐藥檢測(cè)的未來(lái)發(fā)展

HIV-1表型和基因型耐藥性檢測(cè)各有優(yōu)勢(shì)，互為補(bǔ)充?；蛐湍退帣z測(cè)更簡(jiǎn)單適用。但產(chǎn)生多種突變位點(diǎn)和復(fù)雜的交互作用，多種治療方案都無(wú)法得到理想治療效果，或評(píng)估病毒對(duì)新藥物的敏感性時(shí)，需快速、簡(jiǎn)單、有效的表型耐藥檢測(cè)方法。目前尚未有標(biāo)準(zhǔn)化的HIV-1耐藥表型檢測(cè)系統(tǒng)，未來(lái)會(huì)向著更易于操著，耗時(shí)短，結(jié)果穩(wěn)定可靠的方向發(fā)展。

[1]王隴德.中國(guó)艾滋病的流行與控制[M].北京衛(wèi)生出版社:541-549.

[2]邵一鳴.HIV耐藥監(jiān)測(cè)策略和檢測(cè)技術(shù)[M].人民衛(wèi)生出版社:1-210.

[3]王佑春.艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)與質(zhì)量保證[M].科學(xué)出版社:197-216.

[4]吳守麗，HIV耐藥性耐藥檢測(cè)研究進(jìn)展[J].中國(guó)病毒學(xué)雜志，2012，2.

[5]賈豫晨，HIV-1耐藥性研究進(jìn)展[J].云南醫(yī)藥，2013，34

[6]喬錄新，艾滋病毒1型表型耐藥檢測(cè)研究進(jìn)展[J]國(guó)際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志，2012.

[7]左中寶，抗病毒治療患者HIV耐藥發(fā)生的研究[J].傳染病信息，2015，28.