外泌體在膠質(zhì)瘤中的研究進(jìn)展

李晨龍，王斯文，侯偉良，鄭宏山，梁 鵬 （哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江哈爾濱150001）

0 引言

膠質(zhì)瘤來(lái)自神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞，是惡性程度最高的腦腫瘤［1］。根據(jù)CBTRUS統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，膠質(zhì)瘤的發(fā)病率約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的32%，且約占原發(fā)惡性腫瘤的80%［2］。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是致死率最高的原發(fā)惡性腦腫瘤，其中位生存期約為14.6個(gè)月［3］，臨床上常用的治療方案包括手術(shù)切除及術(shù)后同步的放化療［4］。因膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，使其難以全部切除，因此，膠質(zhì)瘤的治療成為醫(yī)學(xué)界的一大難點(diǎn)。

腫瘤細(xì)胞之間可以通過(guò)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行通訊，進(jìn)而影響周邊細(xì)胞的生物學(xué)行為。膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間可以利用各種細(xì)胞分泌因子，達(dá)到細(xì)胞間通訊的目的，而包裹這些相關(guān)分泌因子的結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs）。 EVs是一類(lèi)無(wú)細(xì)胞器的細(xì)胞基質(zhì)，封閉在球形脂質(zhì)雙層分子中，并且依據(jù)其來(lái)源及體積進(jìn)行分類(lèi)。來(lái)自多泡體（multi-vesicular bodies，MVBs）的囊泡常被稱(chēng)作外泌體，因其直接由細(xì)胞質(zhì)膜生成，又稱(chēng)作細(xì)胞微泡［5］。細(xì)胞在處于外界壓力或死亡狀態(tài)，以及凋亡小體引起的胞膜空泡化過(guò)程中，可以向微環(huán)境中排出一些物質(zhì)［5］。很明顯，外泌體作為一種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)參與了一系列重要的生理過(guò)程，包括細(xì)胞間的蛋白質(zhì)和RNA交換，誘導(dǎo)血管生成等［6-8］。目前，外泌體在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不清楚。

1 外泌體的生物學(xué)特性

1.1 外泌體的構(gòu)成外泌體的直徑為40～120 nm，可以通過(guò)100 000 rpm／min離心得到（在蔗糖梯度中浮力密度在 1.13 ～ 1.19 g／mL）［9］。 通過(guò)電子顯微鏡觀察顯示外泌體為球狀的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)［10］。其含水內(nèi)核或脂質(zhì)膜內(nèi)部含有多種蛋白質(zhì)、核酸以及細(xì)胞因子，其組成由分泌的細(xì)胞來(lái)源決定［2，9］。

目前已發(fā)現(xiàn)多種外泌體相關(guān)蛋白，但其核心組成尚不明確。研究［11］發(fā)現(xiàn)，在融合進(jìn)入細(xì)胞與囊泡出芽過(guò)程中，脂類(lèi)在維持細(xì)胞膜硬度和穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用。外泌體含有的脂類(lèi)成分復(fù)雜，據(jù)報(bào)道［12-13］有多種脂類(lèi)成分存在于外泌體的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)中，包括類(lèi)固醇、鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷酯酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、神經(jīng)節(jié)苷脂GM3和前列腺素等物質(zhì)。并且，外泌體中還具有多種功能的細(xì)胞膜相關(guān)蛋白，包括粘附分子和四跨膜蛋白超家族（CD9、CD63、CD81、CD82），ICAM-1和整合素，細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和細(xì)胞膜融合相關(guān)（Rab蛋白，鈣磷脂結(jié)合蛋白），MVB形成相關(guān)蛋白（Alix， TSG101）［14］，其他可能存在的蛋白主要由細(xì)胞類(lèi)型以及分離的方式?jīng)Q定。

1.2 外泌體與膠質(zhì)瘤相關(guān)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者術(shù)后出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，主要與腫瘤侵襲性生長(zhǎng)的特性有關(guān)，有研究［15-17］顯示一些具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性的腫瘤細(xì)胞具有形成侵襲性偽足的特征。而由細(xì)胞粘附因子、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑、配體以及肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白構(gòu)成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同發(fā)揮水解侵襲性偽足的功能［18］。 有研究［19］發(fā)現(xiàn)外泌體可以和侵襲性偽足發(fā)揮協(xié)作關(guān)系，改變或者降解周?chē)募?xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。并且，外泌體可以通過(guò)改變周?chē)С旨?xì)胞的生物學(xué)表型，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的微環(huán)境。而在細(xì)胞中加入間質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體，進(jìn)行共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的能力，研究［20］發(fā)現(xiàn)其不僅可以影響腦部正常的支持細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞），還可以使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的其他亞型發(fā)生表型的改變。因此，細(xì)胞間的外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可以作為研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生物起源和細(xì)胞發(fā)展的潛在作用因素。

外泌體是腫瘤細(xì)胞分泌的代謝產(chǎn)物、生長(zhǎng)因子、離子和細(xì)胞因子等復(fù)雜物質(zhì)的延伸［16］。既往研究［15-17，21］已確定外泌體可以介導(dǎo)組蛋白、致癌因子（EGFRvIII）、miRNA 以及腫瘤抑制因子（PTEN）在膠質(zhì)瘤中的轉(zhuǎn)運(yùn)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的外泌體參與了腫瘤微環(huán)境的形成，包括功能性RNA的轉(zhuǎn)錄、血管生成、克隆形成能力，以及旁分泌途徑誘導(dǎo)的增殖能力增強(qiáng)、免疫耐受能力或誘導(dǎo)正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變的過(guò)程有關(guān)［22-25］。并且，膠質(zhì)瘤來(lái)源的外泌體可以改變細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌，并同時(shí)可以通過(guò)改變免疫細(xì)胞的吞噬能力影響腫瘤微環(huán)境中的免疫功能［20，26］。

2 基于外泌體的診斷

2.1 膠質(zhì)瘤分泌外泌體的可檢測(cè)性膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性特征使得患者的生存期各不相同，因此，需要更多的可以監(jiān)控疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)的方法。而檢測(cè)外泌體中含有的功能性分子標(biāo)志物具有一定意義，通過(guò)收集含有患者外泌體的液體活檢標(biāo)本，以微創(chuàng)的方式監(jiān)控疾病的進(jìn)展，可以使膠質(zhì)瘤患者診斷和個(gè)性化治療方案發(fā)生深刻的變革［27］。在膠質(zhì)瘤的診斷中，結(jié)合外泌體中標(biāo)志物的檢測(cè)方法可以補(bǔ)充現(xiàn)有的組織活檢病理學(xué)和MRI診斷方式的不足，有助于對(duì)患者的腫瘤進(jìn)展進(jìn)行監(jiān)控。并且液體活檢外泌體中分子標(biāo)志物的方法具有創(chuàng)傷小、可靠性強(qiáng)的特點(diǎn)。通過(guò)分離腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體并進(jìn)行富集，與健康人群循環(huán)系統(tǒng)中外泌體中所含有的分子進(jìn)行比較，得到差異表達(dá)分子［28］。

目前已經(jīng)可以從膠質(zhì)瘤患者血液樣本和腦脊液中分離外泌體，其中包含腦腫瘤細(xì)胞來(lái)源的蛋白、脂類(lèi)、RNA和DNA。提示基于膠質(zhì)瘤來(lái)源的外泌體是可以離開(kāi)腦實(shí)質(zhì)并進(jìn)入外周循環(huán)［9］。隨后通過(guò)使用多種方法分離外泌體，包括超速離心及過(guò)濾法，或抗體聚集法，將外泌體從患者的體液樣本中分離出來(lái)。而相對(duì)于既往腫瘤活檢或切除這種高度侵襲性的取材方式，生物體液樣本的外泌體分離可以在患者的整個(gè)治療過(guò)程中多次進(jìn)行［29］，更具有腫瘤進(jìn)展檢測(cè)的意義。

2.2 膠質(zhì)瘤分泌外泌體的腫瘤特異性腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體中富含腫瘤特異性分子，相比腫瘤細(xì)胞內(nèi)含量高出近百倍。而腦脊液是外泌體研究中最具有吸引力的，因?yàn)槟X脊液避開(kāi)了血腦屏障對(duì)胞外囊泡濃度的限制，可以輕松穿越進(jìn)入外周循環(huán)。腦脊液相對(duì)于血液循環(huán)來(lái)源非腫瘤細(xì)胞的外泌體或血小板來(lái)源的微粒相比，具有“雜質(zhì)”少的特點(diǎn)［30］。

目前已有一些細(xì)胞核外RNA被確認(rèn)為膠質(zhì)瘤特異性生物標(biāo)志物，包括突變型EGFRvIII、IDH1和miR-21［31］。收集膠質(zhì)瘤患者腦脊液中外泌體后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核外野生型EGFR表達(dá)水平與化療反應(yīng)存在相關(guān)性，并且可以作為膠質(zhì)瘤患者藥物敏感性的潛在生物標(biāo)志物，如高達(dá)70%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中存在EGFR 過(guò)表達(dá)［32-33］。 并且，研究［34］顯示 EGFRvIII 的表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的傳統(tǒng)分子亞型存在相關(guān)性，通過(guò)檢測(cè)外泌體EGFRvIII的表達(dá)水平，可以為患者制定個(gè)體化治療［35］。通過(guò)使用免疫磁性外泌體（iMER）技術(shù)檢測(cè)標(biāo)志物EPHA2，可使膠質(zhì)瘤組織的識(shí)別率達(dá)84.4%，檢測(cè)EGFR可達(dá)78.1%，而通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)這兩種標(biāo)志物，可使膠質(zhì)瘤組織的總體檢測(cè)正確率達(dá)到90%［36］。研究已知 miR-21可以調(diào)節(jié) EGFR的表達(dá)，并且已在100%的膠質(zhì)瘤患者的腦脊液中檢測(cè)到，提示miR-21為檢測(cè)膠質(zhì)瘤的一種高度敏感的標(biāo)志物，并且實(shí)驗(yàn)證實(shí)與腫瘤轉(zhuǎn)移的微環(huán)境的調(diào)控有關(guān)［37］。由于IDH1突變與原神經(jīng)分子亞型相關(guān)，已有研究證實(shí)其突變與良好的臨床預(yù)后相關(guān)［36，38］。

2.3 外泌體作為化療耐藥標(biāo)志物的研究外泌體可以作為腫瘤化療的敏感性依據(jù)，甲基鳥(niǎo)嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）在替莫唑胺治療膠質(zhì)瘤過(guò)程中可以發(fā)揮修復(fù)損傷的DNA雙鏈的作用。在膠質(zhì)瘤患者中，MGMT啟動(dòng)子DNA甲基化上調(diào)可以減少細(xì)胞中特定核蛋白的表達(dá)，通過(guò)對(duì)患者的血清進(jìn)行iMER檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于耐藥人群，在接受莫唑胺治療后，其外泌體mRNA表達(dá)水平升高［38］。此外，miR-603和miR-181d的表達(dá)水平改變同樣與MGMT表達(dá)水平相關(guān)［39］。由于外泌體MGMT的mRNA水平是可進(jìn)行檢測(cè)的，因此可在治療期間對(duì)患者的化療反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

3 基于外泌體的治療

3.1 抑制外泌體生成、吸收和分泌已有證據(jù)顯示外泌體在膠質(zhì)瘤的生物進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用，靶向外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用的治療成為了一個(gè)新的治療領(lǐng)域。通過(guò)使用外泌體生成抑制劑可以影響細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，減輕細(xì)胞內(nèi)的囊泡形成［40］。Rab GTP酶被公認(rèn)為人類(lèi)疾病的重要靶點(diǎn)，其自身發(fā)生突變或者表達(dá)下調(diào)均可引起一系列疾病的發(fā)生［41］。借助于外泌體調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的物質(zhì)交換，Rab GTP酶在細(xì)胞信號(hào)傳遞和外部刺激的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。而抑制Rab27a的表達(dá)可以在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中減少癌癥促進(jìn)性外泌體的釋放，抑制原位腫瘤的生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［42］。

3.2 外泌體藥物靶向投遞系統(tǒng)由于外泌體具有較長(zhǎng)的循環(huán)半衰期，內(nèi)在的靶向受體腫瘤細(xì)胞能力，生物相容性和低毒性等良好特性，因此可以構(gòu)建成為理想的藥物投遞系統(tǒng)［43］。最近，來(lái)自于內(nèi)皮細(xì)胞的外泌體被應(yīng)用于投遞紫杉醇和阿霉素跨越血腦屏障進(jìn)入腦部發(fā)揮作用，抑制了腫瘤的生長(zhǎng)［44］，顯示了外泌體治療的優(yōu)勢(shì)。在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)工程改造來(lái)自樹(shù)突狀細(xì)胞，表達(dá)一定數(shù)目膜蛋白的外泌體，成功地穿越血腦屏障進(jìn)行siRNA投遞。

3.3 外泌體與 miRNAGallo 等［45］通過(guò)檢測(cè)全血、尿液、唾液、腦脊液和外泌體中的miRNA水平后，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)細(xì)胞外miRNA實(shí)際上存在于外泌體中。外泌體包裹RNA后可以保護(hù)其免受細(xì)胞外RNA酶的降解，而外泌體則扮演了細(xì)胞間miRNA搬運(yùn)工的角色，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)mRNA的翻譯［46］。目前尚無(wú)法確認(rèn)所有的外泌體中均含有RNA，但是一些研究顯示腫瘤來(lái)源的外泌體可能還由與親代細(xì)胞不同的RNA組成［47-59］。并且，外泌體釋放進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境時(shí)，其中含有的RNA的選擇和包裝的機(jī)制目前尚未研究清楚［51］。

4 展望

目前已知外泌體和其他細(xì)胞外囊泡可以通過(guò)傳遞多種分子和物質(zhì)用于供體和受體細(xì)胞之間的遠(yuǎn)距離通訊。并且越來(lái)越多的研究顯示外泌體可以參與多種腫瘤的生物學(xué)過(guò)程，而腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體不僅存在于腫瘤的進(jìn)展過(guò)程，也同樣應(yīng)用于周邊微環(huán)境的修飾，最終積極地改變了腫瘤的微環(huán)境，使腫瘤細(xì)胞存活下來(lái)。目前對(duì)于膠質(zhì)瘤外泌體研究領(lǐng)域，還需進(jìn)行更多深入的研究：包括優(yōu)化分離技術(shù)、膠質(zhì)瘤相關(guān)外泌體的特征研究和外泌體標(biāo)志物的檢測(cè)方法，最終可以使外泌體的投遞成為診斷、預(yù)后和靶向治療的潛在作用靶點(diǎn)，減少膠質(zhì)瘤治療時(shí)的脫靶效應(yīng)，提高患者生存期，從而有望成為臨床治療膠質(zhì)瘤的一個(gè)突破點(diǎn)。