環(huán)狀RNA在膠質(zhì)瘤中的研究進(jìn)展

朱 磊，董 倫，張恒柱 （大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 6044；江蘇省蘇北人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 揚州 500）

0 引言

膠質(zhì)瘤約占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40%～60%［1］，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，世界衛(wèi)生組織（WHO）根據(jù)腫瘤的細(xì)胞和組織學(xué)特點，將其分為Ⅰ～Ⅳ級。膠質(zhì)瘤可發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的任何部位和任何年齡，平均存活期僅為14個月［1］，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度最高，預(yù)后最差，95%未經(jīng)治療的患者生存期不超過3個月。膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展涉及細(xì)胞周期與信號傳導(dǎo)通路、基因表達(dá)等多方面內(nèi)容的改變。因此，研究膠質(zhì)瘤，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的相關(guān)分子機制，探索新的、安全有效的診療方法具有重要意義。

環(huán)狀RNA（circRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種特殊類型的RNA，是指3′端與5′端共價結(jié)合形成的閉合單鏈環(huán)狀RNA，由Sanger等［2］于1976年在類病毒研究中發(fā)現(xiàn)，并首次提出此概念。由于早期普遍認(rèn)為circRNA是基因表達(dá)中的副產(chǎn)物，因此關(guān)于環(huán)狀RNA的研究也停滯不前。近年來，隨著分子生物學(xué)及分子測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，環(huán)狀RNA的潛在特性和功能逐漸被發(fā)現(xiàn)。有研究［3］指出，環(huán)狀RNA在神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富，呈現(xiàn)動態(tài)表達(dá)的特點，而且可能參與了膠質(zhì)瘤的增殖、轉(zhuǎn)移等多個生物學(xué)過程［4］，有望成為膠質(zhì)瘤的新型診斷標(biāo)志物，并為治療提供新的思路和方向。本文主要介紹環(huán)狀RNA的形成、特點及功能，并討論在膠質(zhì)瘤中的作用。

1 環(huán)狀RNA的產(chǎn)生、特點和功能

1.1 環(huán)狀RNA的產(chǎn)生環(huán)狀RNA的具體產(chǎn)生機制尚未明確，根據(jù)前體序列的來源可分為外顯子形成的環(huán)狀 RNA［4］、內(nèi)含子形成的環(huán)狀 RNA［5］、外顯子和內(nèi)含子共同組成的環(huán)狀 RNA［6］及 tRNA前體形成的環(huán)狀RNA［7］。 ①外顯子來源的環(huán)狀 RNA（exo circRNA），其形成主要有直接反式剪接（或稱內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化）和外顯子跳讀（套鎖驅(qū)動環(huán)化）兩種機制，過程復(fù)雜，需ALU重復(fù)序列等多種因子參與。前者是一個外顯子的3′端剪接供體與上游的5′端剪接受體結(jié)合，切除內(nèi)含子，然后形成環(huán)狀 RNA［4］；后者是內(nèi)含子之間配對形成環(huán)狀套鎖，再剪切其中的內(nèi)含子，最后形成環(huán)狀RNA［8］。②內(nèi)含子來源的環(huán)狀RNA（ciRNA），形成依賴于外源性鳥苷（exoG）、5′端剪接區(qū)域7 nt長的富含GU的序列及靠近分支部位的11 nt的富含C的序列，此類環(huán)狀RNA較為少見，但具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用［5］。③外顯子和內(nèi)含子共同組成的環(huán)狀RNA（EIciRNAs），通過直接反向剪接形成，內(nèi)含子不被剪切，保留其中。這類EIciRNAs只存在于細(xì)胞核中，能夠促進(jìn)親本基因的轉(zhuǎn)錄［6］。④tRNA前體形成的環(huán)狀 RNA（tricRNA），如tric31905，其形成需要保守的tRNA及加工酶的參與，但具體的機制及功能尚未明確［7］。

1.2 環(huán)狀RNA的特點①分布廣泛，含量豐富。據(jù)報道，環(huán)狀RNA廣泛分布在原核和真核細(xì)胞中，從病毒、果蠅到人類細(xì)胞都有環(huán)狀RNA的存在［3］；10%以上人類基因可以轉(zhuǎn)錄生成環(huán)狀 RNA［9］，You 等［10］指出，腦組織中約20%的編碼蛋白的基因可以產(chǎn)生環(huán)狀RNA。②結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，半衰期長。環(huán)狀RNA無5′帽結(jié)構(gòu)和3′-PolyA尾結(jié)構(gòu)，對RNA核酸外切酶和脫支酶有一定抵抗性［11］，大多數(shù)環(huán)狀 RNA半衰期超過48 h［12］，比線性 RNA 半衰期（約 10 h）長［13］，然而環(huán)狀RNA核酸內(nèi)切酶可使內(nèi)含子來源的環(huán)狀RNA水解，其半衰期（小于 15 s）較短［14］。 ③高度保守，表達(dá)特異。共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)使環(huán)狀RNA穩(wěn)定性好，導(dǎo)致保守性高，而且序列長度在進(jìn)化中也高度保守［3］；You等［10］指出環(huán)狀RNA首尾相接處的外顯子更具有高度的保守性。環(huán)狀RNA的表達(dá)具有時間和空間特異性，Rybak-Wolf等［3］在實驗中證實，相對其他組織，環(huán)狀 RNA（如 circRims2、circTulp4、circPhf21a等）不僅在人和鼠等哺乳類動物腦組織中表達(dá)豐富，甚至在果蠅中也是這樣。另外，環(huán)狀RNA表達(dá)具有組織特性，其中嗅球、前額葉皮質(zhì)、海馬、小腦等高表達(dá)特定種類的環(huán)狀RNA；在神經(jīng)元的不同部位，環(huán)狀RNA的含量也不相同，突觸中的豐富度最高，這可能與皮質(zhì)中突觸密度高、ALU重復(fù)序列多等有關(guān)。環(huán)狀RNA表達(dá)也具有分化發(fā)育階段的特異性，其增多通常伴隨著宿主轉(zhuǎn)錄的上調(diào)，當(dāng)然也有例外，比如環(huán)狀RNAZfp609（circZfp609）在神經(jīng)元分化過程中持續(xù)定量表達(dá)，這提示環(huán)狀RNA在腦組織分化發(fā)育中可能具有重要作用。除此之外，環(huán)狀RNA在肺、胰腺、膀胱、胃、直腸等組織中均有表達(dá)，而且可以隨著組織器官的發(fā)育而表達(dá)，如心臟中的NCXI就隨著發(fā)育的不同階段被誘導(dǎo)表達(dá)［15］。

1.3 環(huán)狀RNA的功能（1）海綿作用。①miRNA的海綿作用［16］。miRNA是一類長度約21 nt，與mRNA靶向結(jié)合的 RNA［17］。環(huán)狀 RNA具有與 miRNA結(jié)合位點，起到抑制其對應(yīng)miRNA的降解作用。如小腦退化相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物（CDR1as／ciRS-7）在小腦中表達(dá)豐富，具有miR-7的應(yīng)答元件，通過海綿作用減弱miR-7的生物學(xué)功能［18］。在星形細(xì)胞瘤中miR-7表達(dá)下調(diào)，使得膠質(zhì)瘤迅速生長，但并非miR-7越高對腫瘤抑制性越強，有報道稱肺癌的不良預(yù)后就與miR-7的高表達(dá)有關(guān)［19］。②蛋白質(zhì)的海綿作用。這種環(huán)狀RNA被稱為蛋白質(zhì)海綿，如CDR1as／ciRS-7可與 AGO蛋白（Argonaute）結(jié)合，從而使自身被降解［20］。（2）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。 如前所述，環(huán)狀 RNA具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。ciRNA中如錨蛋白重復(fù)域 52（ciankrd52）可與RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合體相互作用，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［21］。（3）翻譯作用。眾所周知，大多數(shù)環(huán)狀RNA屬于非編碼RNA，但仍有例外。如丁型肝炎病毒（HDV）的核心是一單股負(fù)鏈的circRNA，其可以轉(zhuǎn)錄翻譯成丁型肝炎核心抗原。（4）其他作用。Talhouarne等［22］發(fā)現(xiàn)ciRNA在細(xì)胞分裂過程中可遺傳給子代細(xì)胞，提示具有遺傳上的作用。由于穩(wěn)定性好，環(huán)狀RNA可能存在其他生物學(xué)功能，比如作為組裝核糖體蛋白（RNP）顆粒的平臺，轉(zhuǎn)運其他蛋白質(zhì)或其他RNAs的良好介質(zhì)，這也為新型腫瘤藥物的研發(fā)提供了新視角。

2 環(huán)狀RNA與腫瘤

近年來，環(huán)狀RNA在腫瘤方面的研究已經(jīng)取得了一定的成果。如Huang等［23］對結(jié)腸癌的分析表明，cir-ITCH在結(jié)腸癌中表達(dá)明顯下降，通過海綿作用與親本的 ITCH基因競爭 miR-7和 miR-20，抑制Wnt／β-catenin 信號 傳 導(dǎo)通路；Li等［24］發(fā)現(xiàn) circRNA002059在胃癌中表達(dá)下降，與胃癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移等相關(guān)；Huang等［25］發(fā)現(xiàn)circRNA MYLK可以競爭性結(jié)合 miRNA-29a-3p，導(dǎo)致膀胱癌的發(fā)生；Xuan等［26］研究指出，has-circ-100855在喉癌上調(diào)明顯，而has-circ-104912在喉癌中卻下調(diào)明顯等，諸多研究均提示環(huán)狀RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。

3 環(huán)狀RNA與膠質(zhì)瘤

3.1 環(huán)狀RNA與膠質(zhì)瘤的研究逐步興起Song等［27］研發(fā)了一種UROBORUS新型檢測工具，他們利用46個膠質(zhì)瘤（包括少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和GBM）和正常腦組織樣本作研究，發(fā)現(xiàn)所有樣本中高表達(dá)的環(huán)狀RNA的外顯子數(shù)量沒有顯著的差異，大約10%的環(huán)狀RNA只含有一個外顯子；而且大多數(shù)環(huán)狀RNA反向剪接點的基因長度在50 kb內(nèi)，只有少數(shù)在100～300 kb之間。此外，研究還發(fā)現(xiàn)RIMS基因在正常腦組織會產(chǎn)生5種環(huán)狀RNA異構(gòu)體，而在膠質(zhì)瘤中只有2種，這提示膠質(zhì)瘤會減少RIMS基因形成環(huán)狀RNA異構(gòu)體的數(shù)量。然而，并非所有基因都是如此，VCAN在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中形成環(huán)狀RNA異構(gòu)體數(shù)量沒有差別，但circ_VCAN的表達(dá)在膠質(zhì)瘤中卻比正常腦組織高，而且有實驗［27-28］證實VCAN基因是形成膠質(zhì)瘤的責(zé)任基因。GBM中表達(dá)的circ_COL1A2、circ_PTN、circ_VCAN、circ_SMO、circ_PLOD2、circ_GLIS3、circ_EPHB4、circ_CLIP2 較正常腦組織高，提示此8種環(huán)狀RNA有可能成為GBM的腫瘤標(biāo)志物。

3.2 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 （glioblastoma multiforme， GBM）GBM 涉及 miR-671-5p／CDR1-AS／CDR1／VSNL1軸的表達(dá)失調(diào)［29］。 小腦退化相關(guān)蛋白1 反義轉(zhuǎn)錄物（CDR1-AS）是 2011 年由 Hasen 等［30］發(fā)現(xiàn)的一類環(huán)狀RNA，具有miR-671-5p的結(jié)合靶點，在GBM細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。Barbagallo等［29］研究了45位GBM患者的活檢組織和5個 GBM（分別是A172，CAS-1、DBTRG、SNB-19、U-87）細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn) miR-671-5p在GBM活檢組織和細(xì)胞株中均過度表達(dá)，其中miR-671-5p在A172、CAS-1、DBTRG細(xì)胞株中的表達(dá)超過其他腫瘤細(xì)胞株（A375，HCT116）的兩倍。且發(fā)現(xiàn) CDR1-AS、CDR1、視錐蛋白樣因子 1（VSNL1）作為miR-671-5p的下游分子，在GBM細(xì)胞中表達(dá)減少，與miR-671-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其中 CDR1-AS表達(dá)下調(diào)了 3.51 倍，CDR1 下調(diào)了 2.84 倍，VASNL1 下調(diào)了 2.1倍，而且發(fā)現(xiàn)miR-671-5p能促進(jìn)GBM細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖。轉(zhuǎn)染miR-671-5p的類似物24 h后，發(fā)現(xiàn)DBTRG、SNB-19、U-87細(xì)胞株中GBM細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力分別增加了15%、32%、15%。DBTRG細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-671-5p類似物24 h后生存能力增加了16%，而使用抑制物72 h后則使其生存能力下降了12%；同樣，SNB-19細(xì)胞株轉(zhuǎn)染類似物48 h后，其生存力增加了9%，轉(zhuǎn)染抑制物72 h后，下降了7%；U-87細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-671-5p類似物后，生存能力增加了5%，而轉(zhuǎn)染抑制劑48 h后，生存能力會下降19%；故此推測GBM 涉及 miR-671-5p／CDR1-AS／CDR1／VASNL1 軸的表達(dá)失調(diào)。

3.3 膠質(zhì)瘤涉及 circ-TTBK2／miR-217／HNF1β／Derlin-1軸的表達(dá)失調(diào)TTBK2環(huán)狀RNA（circ-TTBK2，根據(jù)環(huán)狀 RNA數(shù)據(jù)庫也稱 circ-0000594），由TTBK2基因的外顯子 3、4、5、6產(chǎn)生，不含內(nèi)含子，定位于胞漿中，Zheng等［29］發(fā)現(xiàn)與正常腦組織相比，circ-TTBK2在膠質(zhì)瘤中明顯表達(dá)上調(diào)，能抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，而且和膠質(zhì)瘤的病理分級呈正相關(guān)。此外，利用正常星形膠質(zhì)細(xì)胞作對比，發(fā)現(xiàn)miR-217在膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞株表達(dá)下調(diào)，而且使miR-217恢復(fù)正常表達(dá)能起到抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用，因此推測miR-217在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮了腫瘤抑制作用。進(jìn)一步指出circ-TTBK2以RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的方式減少miR-217在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)。肝細(xì)胞核因子1β（HNF1β）定位在胞核，它不僅是肝臟特殊轉(zhuǎn)錄因子，而且在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。在細(xì)胞株中加入 circ-TTBK2抑制子和／或使miR-217過表達(dá)，HNF1β表達(dá)量均明顯減少，為了更深入了解 miR-217與 HNF1β的關(guān)系，將 HNF1β的3′-UTR 和非HNF1β 3′-UTR 作比較，結(jié)果是膠質(zhì)瘤細(xì)胞在 miR-217+HNF1β 3′-UTR 組比 miR-217+HNF1β的遷移性和侵襲性要高，這表明miR-217是通過和HNF1β 3′-UTR相互作用調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)通路的。HNF1β作為Derlin-1的啟動子促進(jìn)Derlin-1的表達(dá)，而Derlin-1則是通過激活PI3K／AKT／ERK發(fā)揮致癌因子的作用，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，抑制細(xì)胞的凋亡。和circ-TTBK2相似，HNF1β也與膠質(zhì)瘤的病理分級呈正相關(guān)。

3.4 沉默 cZNF292 能通過 Wnt／β-catenin 信號傳導(dǎo)通路抑制膠質(zhì)瘤血管生成和細(xì)胞增殖cZNF292是一種致癌性的環(huán)狀RNA，通過作用于Wnt／β-catenin通路即 Axin／β-catenin／APC／STAT3／5 通路在腫瘤的血管生成和細(xì)胞增殖方面扮演了重要角色。Yang等［30］在體外U87MG和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，沉默cZNF292的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）及其受體 1／2（VEGFR-1／2）、磷酸化的血管內(nèi)皮生長因子受體（p-VEGFR-1／2）、內(nèi)皮生長因子（EGF）、內(nèi)皮生長因子受體（EGFR）及轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）表達(dá)水平均下降，這提示沉默cZNF292的表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤的血管生成。另外，膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期會停留在S／G2／M期，這是由調(diào)控細(xì)胞周期增殖的Wnt／β-catenin信號傳導(dǎo)通路，包括軸蛋白（Axin）、β-鏈蛋白（β-catenin）、磷酸化轉(zhuǎn)錄激活因子 3（p-STAT3）、磷酸化轉(zhuǎn)錄激活因子5（p-STAT5）及其下游效應(yīng)分子如周期蛋白 A（cyclinA）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK2）、多脯氨酸蛋白 11（PRR11）等表達(dá)失調(diào)所致，當(dāng)然其中還涉及其他分子如 E2F1、NF-κB、Sp1、HIF-1、AP-1等的轉(zhuǎn)錄下調(diào)。而CyclinA的作用就是激活CDK2推動細(xì)胞增殖周期從S期進(jìn)入G2期。然而更深層次的調(diào)控機制有待進(jìn)一步研究。

3.5 circBRAF可以用來預(yù)測GBM患者的無進(jìn)展生存期和總生存期circBRAF定位在7號染色體，由BRAF基因的外顯子產(chǎn)生，BRAF基因可能與多種信號調(diào)節(jié)通路有關(guān)，包括Erb信號通路、MAPK信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、mTOR信號通路。Zhu等［31］在研究中指出，相對正常腦組織，circBRAF的表達(dá)在膠質(zhì)瘤患者低，而且高級別的GBM（WHO分級Ⅲ～Ⅳ）表達(dá)比低級別的GBM（WHO分級Ⅰ～Ⅱ級）低，提示circBRAF表達(dá)量高的GBM患者無進(jìn)展生存期和總生存期較好。具體的機制尚不清楚，可能是因為下調(diào)表達(dá)環(huán)狀RNA參與了神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路。另外，Zhu等［31］在研究中發(fā)現(xiàn)了1411種差異表的達(dá)環(huán)狀RNA，GO分析表明，下調(diào)的環(huán)狀RNA與蛋白結(jié)合及修飾、轉(zhuǎn)運活動、細(xì)胞器組織等有關(guān)，上調(diào)的環(huán)狀RNA與受精、G0到G1期的轉(zhuǎn)變、錳離子轉(zhuǎn)運、精子獲能、鈣池操縱的鈣離子通道活動、肌動蛋白依賴性ATP酶有關(guān)。

4 問題與展望

迄今為止，人們對circRNA認(rèn)識大多數(shù)屬于起步階段，尤其是在膠質(zhì)瘤領(lǐng)域，雖有研究表明膠質(zhì)瘤涉及相關(guān)circRNA的改變，但深層次的機制仍不清楚，甚至部分環(huán)狀RNA是否真正與膠質(zhì)瘤有關(guān)仍需進(jìn)一步研究，而且實驗研究面臨著儀器設(shè)備昂貴、技術(shù)要求高、分析普窄等問題。將circRNA應(yīng)用于臨床疾病診治還有很長的路要走，但毫無疑問，對circRNA的研究可能為神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤的診治提供新的方向和思路，打開更為廣闊的空間。