鴨病毒性肝炎的研究進(jìn)展

楊同濤，劉建濤，孫法良，崔京騰

（齊魯動(dòng)物保健品有限公司，山東 濟(jì)南 250100）

鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus，DHV)引起雛鴨的一種高度致死性傳染病[1]。臨床上具有明顯神經(jīng)癥狀和肝臟腫大、表面呈斑點(diǎn)樣出血為特征。其主要侵害6周齡以內(nèi)雛鴨，尤以2日至3周的雛鴨最為易感，成年鴨有抵抗力。感染不同類(lèi)型病毒性肝炎和不同日齡的雛鴨發(fā)病后死亡率有所不同，有的高達(dá)95%，有的低于15%。隨著近幾年中國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)快速發(fā)展，該病已成為危害中國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的疫病之一，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本文對(duì)鴨肝炎病毒的流行病學(xué)、病原學(xué)、診斷與疫苗研究等方面進(jìn)行了綜述。

1 鴨病毒性肝炎流行病學(xué)研究進(jìn)展

鴨肝炎病毒（Duck Hepatitis Virus，DHV）包含小核糖核酸病毒科、星狀病毒科、嗜肝病毒科3個(gè)病毒科的4種病毒[2]。嗜肝病毒科的鴨肝炎病毒引起鴨乙型肝炎，但該病毒對(duì)各年齡段鴨沒(méi)有顯著的致病性，本文不做論述；星狀病毒科引起血清Ⅱ型、Ⅲ型鴨肝炎，小核糖核酸病毒科引起血清Ⅰ型鴨肝炎。

1.1 鴨病毒型肝炎發(fā)生與分布 Ⅰ型鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1，DHV-1)于 1945 年在美國(guó)被Levine等首次發(fā)現(xiàn)，可惜由于當(dāng)時(shí)的條件限制未能分離出病毒，直到1950年，美國(guó)人Levine和Fabricant從雞胚中首次分離到病原，該病原體就是后來(lái)的I型鴨肝炎病毒(Duckhepatitis virus type 1，DHV-1)[3]。 1965年在英格蘭的諾福克 （Norfolk） 發(fā)生了與Ⅰ型鴨肝炎病毒(Duckhepatitisvirus type 1，DHV-1)病理性質(zhì)相似的病例，但發(fā)病鴨群已經(jīng)免疫過(guò)Ⅰ型DHV弱毒株，雛鴨交叉免疫保護(hù)試驗(yàn)證明，所分離出的病原與Ⅰ型DHV不同，故被命名為Ⅱ型 DHV（后來(lái)被命名為 DAst V-1）[4]。Toth在紐約長(zhǎng)島發(fā)現(xiàn)了一種可以引起對(duì)Ⅰ型DHV有免疫力的雛鴨發(fā)病和死亡的病毒，但不如Ⅰ型DHV感染嚴(yán)重。由于該病毒與Ⅰ型和Ⅱ型DHV不同，被命名為Ⅲ型DHV（后來(lái)被命名為 DAst V-2）[5]。 Ⅰ型 DHV呈世界分布，Ⅱ型DHV局限于英格蘭，Ⅲ型主要局限于美國(guó)，在 1998～1999年，程安春在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)有Ⅲ型 DHV的存在。目前對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)危害比較大的主要是Ⅰ型和Ⅲ型DHV。

1.2 鴨病毒型肝炎流行特點(diǎn) 鴨病毒性肝炎發(fā)病無(wú)明顯季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，其死亡率與感染鴨肝炎病毒血清型、雛鴨日齡、繼發(fā)感染有著密切關(guān)系。該病傳染源是病鴨、感染的康復(fù)鴨和成年鴨，雞、火雞、雛野鴨、雛鵝、鶴鶉、幼鴿等禽類(lèi)可作為其宿主。鴨舍中的鼠類(lèi)和野禽可作為病毒的貯存宿主或媒介[6]。Ⅰ型鴨肝炎病毒自然條件下僅發(fā)生于雛鴨，成年鴨可感染而無(wú)臨床癥狀，產(chǎn)蛋鴨即使在污染的環(huán)境中也無(wú)臨診癥狀，也不影響其產(chǎn)蛋率，但血清與蛋黃中含有中和抗體，傳染源主要通過(guò)糞便排毒，主要引起6周齡以內(nèi)的雛鴨發(fā)病和死亡，小于1周齡雛鴨的死亡率可達(dá)95%，隨日齡增大，死亡率逐漸降低。Ⅱ型鴨肝炎病毒只感染鴨，成年鴨對(duì)該病有抵抗力，未觀察到其有野生儲(chǔ)存宿主或媒介；Ⅲ型鴨肝炎病毒一般只感染雛鴨，其不如Ⅰ型鴨肝炎病毒感染嚴(yán)重，雛鴨的死亡率很少超過(guò)30%。

2 鴨病毒性肝炎病原學(xué)及臨床癥狀

2.1 病原學(xué) I型鴨肝炎病毒，直徑20～40nm，呈球形或類(lèi)球形，核衣殼呈二十面體對(duì)稱(chēng)，含有32個(gè)殼粒，無(wú)囊膜。該病毒屬小RNA病毒，基因組由60個(gè)亞單位組成，每個(gè)亞單位含有四種衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，此外還有基因組結(jié)合蛋白VPg。 VP1、VP2、VP3 彼此不同，均為結(jié)構(gòu)蛋白，基因組含有7209～8450個(gè)堿基對(duì)，為單股正鏈 RNA(ss RNA)，即病毒 RNA 為 mRNA[7]。Ⅱ型 DHV屬于星狀病毒(Astrovirus)，病毒顆粒的形狀呈特征性的帶有頂角的星形，直徑28～30nm，患病鴨肝懸液中可見(jiàn)超過(guò)1000個(gè)病毒顆粒的病毒集合[8]。Ⅲ型DHV屬于小RNA病毒科，經(jīng)中和試驗(yàn)和熒光抗體試驗(yàn)證明Ⅲ型DHV和Ⅰ型DHV無(wú)共同抗原，其在鴨腎細(xì)胞中呈晶格狀排列，病毒粒子直徑30nm。

2.2 臨床及剖檢癥狀 Ⅰ型鴨肝炎的發(fā)生和傳播很快，雛鴨感染主要表現(xiàn)為：雛鴨感染首先表現(xiàn)為精神萎靡，縮頸，翅下垂，不愛(ài)活動(dòng)打磕睡，行動(dòng)呆滯或跟不上群，此后短期內(nèi)即厭食，停止運(yùn)動(dòng)、蹲伏并半閉眼，有的出現(xiàn)腹瀉?；疾▲喅霈F(xiàn)神經(jīng)癥狀，病鴨身體側(cè)臥，兩腿痙攣性踢，發(fā)生全身性抽搐，有時(shí)在地上旋轉(zhuǎn)，死亡時(shí)頭向后背，呈角弓反張姿勢(shì)，少數(shù)病雛鴨死前排黃白色或綠色稀糞。死亡常在3～5d內(nèi)發(fā)生，隨即迅速下降以至停止死亡。死亡雛鴨的喙端和爪尖淤血，呈暗紫色。

剖檢病變主要集中在肝臟，表現(xiàn)為肝臟腫大、質(zhì)脆易碎等現(xiàn)象，且肝臟表面有出血點(diǎn)或出血斑，通常可見(jiàn)肝臟顏色暗淡或發(fā)黃，表面呈斑駁狀；另外，膽囊和脾臟也出現(xiàn)變化，如膽囊腫大并充滿墨綠色膽汁，而脾臟也出現(xiàn)腫大，有時(shí)呈斑駁狀；胰臟腫脹而無(wú)光澤，部分會(huì)出現(xiàn)小的白色病灶，腎臟腫大，表面血管充血、變得較明顯呈樹(shù)枝狀，切面隆起，邊緣外翻；腦膜水腫、充血、出血。部分病例還可見(jiàn)心肌呈淡灰色，質(zhì)軟有淤血，似開(kāi)水煮樣，心房擴(kuò)張，充滿不凝固的血液。

Ⅱ型鴨肝炎病毒感染鴨后會(huì)出現(xiàn)煩渴、拉稀、尿酸鹽分泌過(guò)量的癥狀，有時(shí)可能有抽搐和角弓反張的癥狀，Ⅱ型鴨肝炎病毒的靶器官主要為肝臟和腎臟。肝臟腫大呈淺粉紅色，表面有許多小點(diǎn)狀出血，這種血點(diǎn)常融合成帶狀；脾臟腫大，表面彌散的白色病灶形成“西米樣”外觀；腎臟腫脹，血管充血并凸于腎臟表面；消化道內(nèi)通常沒(méi)有食物，偶爾腸壁心冠脂肪上有小出血點(diǎn)。Ⅲ型鴨肝炎病毒感染的雛鴨與Ⅰ型鴨肝炎病毒典型癥狀相似，即兩腿向后伸和角弓反張，剖檢癥狀也與Ⅰ性鴨肝炎病毒感染相近。

3 鴨病毒性肝炎診斷技術(shù)研究進(jìn)展

3.1 病毒分離技術(shù) 病毒分離技術(shù)是檢測(cè)HV的方法之一，結(jié)合臨床癥狀和流行病學(xué)特征可做出初步診斷。目前，DHV分離技術(shù)主要有鴨胚(或雞胚)尿囊腔接種和動(dòng)物接種2種方法。細(xì)胞培養(yǎng)方面因毒株毒力強(qiáng)弱和對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)程度不同，產(chǎn)生或不產(chǎn)生細(xì)胞病變，到目前為止，這些方法還不適于作為DHV的分離技術(shù)而應(yīng)用[9]。

3.2 血清學(xué)診斷技術(shù) 實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)DHV的病原的方法很多，但是每一種都有自身的優(yōu)缺點(diǎn)。常規(guī)的檢測(cè)方法主要是血清學(xué)方法，包括中和試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、對(duì)流免疫電泳、熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等[10]。用于檢測(cè)DHV病原的方法很多，但是每一種都有自身的優(yōu)缺點(diǎn)。目前，最常用、最可靠的方法仍然是中和試驗(yàn)。中和試驗(yàn)雖是普遍認(rèn)為的權(quán)威診斷方法，但其繁瑣、費(fèi)時(shí)、成本高，不能用于快速診斷，難以在基層中推廣應(yīng)用。

3.3 分子生物學(xué)診斷技術(shù) 近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，專(zhuān)家學(xué)者對(duì)DHV的研究不斷地深入，已經(jīng)建立起檢測(cè)DHV的分子生物學(xué)方法。耿昕穎等建立了DHV PCR-ELISA檢測(cè)方法，用該方法對(duì)50份雛鴨肝提取的RNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為82%，較RT-PCR檢出率高46%。結(jié)果表明，該P(yáng)CR-ELISA方法具有特異、敏感、安全的特點(diǎn)，從而為鴨病毒性肝炎流行病學(xué)研究及臨床診斷提供了新的途徑[11]，其后陸續(xù)有學(xué)者報(bào)道建立了檢測(cè)鴨肝炎病毒抗原的RT-PCR方法。黃顯明等建立了DHV-Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄套式PCR檢測(cè)方法RT-PCR方法具有特異、快速和敏感的特點(diǎn)，可用于鴨病毒性肝炎病毒的快速鑒別診斷[12]。另外，羅玉均等建立了SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)DHV-I，具有較好的特異性、敏感性，為DHV-I的臨床檢測(cè)和流行情況調(diào)查提供了新的技術(shù)手段[13]。

4 鴨病毒性肝炎疫苗研究進(jìn)展

目前使用的鴨病毒性肝炎疫苗主要是弱毒活疫苗和滅活疫苗，基因工程疫苗的研究也取得了一定進(jìn)展。

4.1 弱毒疫苗研究進(jìn)展 一般而言，鴨病毒性肝炎弱毒疫苗，是將鴨肝炎病毒(DHV)在雞胚或鴨胚上連續(xù)傳代，獲得的致弱毒疫苗株。大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道連續(xù)傳代至60～80代的DHV，安全性和免疫原性可達(dá)到較理想的效果，可作為鴨病毒性肝炎弱毒疫苗的候選毒株。Aspli和Reuss分別通過(guò)雞胚傳代致弱的方式，獲得了鴨病毒性肝炎弱毒疫苗株[14]。Hwang等用雞胚連續(xù)傳代至63代時(shí)，病毒毒力比較穩(wěn)定，對(duì)雞胚的致死率達(dá)到100%，對(duì)種鴨用雞胚弱毒苗在1日齡、7周齡和21周齡進(jìn)行三次免疫，在67周產(chǎn)蛋期內(nèi)其子代雛鴨能抵抗強(qiáng)毒攻擊。韓國(guó)學(xué)者Kim等利用發(fā)病雛鴨病料分離的3型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-3)AP-04203株，通過(guò)SPF雞胚連續(xù)傳至100代，獲得致弱疫苗株（AP－04203P100）[15]。 以 103.0ELD50/0.2ml劑量，免疫原性好，無(wú)毒力返強(qiáng)，肌肉注射免疫1日齡雛鴨，2d后以103.0ELD50/0.2ml劑量的強(qiáng)毒株AP－04203攻毒，表現(xiàn)出100%保護(hù)效果。弱毒苗一般雛鴨在1～3日齡免疫?，F(xiàn)在文獻(xiàn)主要是針對(duì)單一血清型弱毒疫苗的研究，由于現(xiàn)在國(guó)內(nèi)I型和Ⅲ型鴨肝病毒，故亟需加快弱毒聯(lián)苗的研究進(jìn)程。

4.2 滅活疫苗研究進(jìn)展 國(guó)外Gough等[16]及Woolcock[17]都成功研制Ⅰ型鴨病毒性肝炎滅活疫苗(鴨胚組織苗)，并證實(shí)以滅活苗作基礎(chǔ)免疫不能產(chǎn)生滿意的抗體應(yīng)答，證實(shí)滅活油乳劑苗免疫種鴨3次，其后代雛鴨可獲得有效保護(hù)，若種鴨2、3日齡時(shí)用弱毒疫苗，以后在22周齡時(shí)再用滅活苗免疫，產(chǎn)生的中和抗體水平要高于用3次滅活苗免疫，所產(chǎn)雛鴨對(duì)強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)力可維持 3周以上。他們還發(fā)現(xiàn)用鴨胚繁殖病毒制備的滅活疫苗所產(chǎn)生的抗體反應(yīng)，要強(qiáng)于用雞胚制備的滅活苗。種鴨未用弱毒苗作基礎(chǔ)免疫，則滅活苗的免疫效果將會(huì)受到影響和限制。國(guó)內(nèi)陳克強(qiáng)等[18]和胡建華等[19]也分別做了鴨肝炎病毒滅活苗的研究，結(jié)果證實(shí)在未基礎(chǔ)免疫情況下滅活苗也能起到很好的保護(hù)效果。研究表明鴨肝炎滅活苗能產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，是否需要基礎(chǔ)免疫國(guó)內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果不統(tǒng)一，后續(xù)需專(zhuān)家們做這方面試驗(yàn)，充分發(fā)揮滅活苗作用。

4.3 基因工程疫苗研究進(jìn)展 基因工程疫苗，是利用現(xiàn)代生物技術(shù)在分子水平上制備的新型疫苗，此方面文獻(xiàn)較少，付玉志等構(gòu)建Ⅰ型鴨肝炎病毒VP1基因的自殺性DNA疫苗，結(jié)果表明，不僅可以明顯誘導(dǎo)雛鴨淋巴細(xì)胞增殖，而且可以誘導(dǎo)雛鴨產(chǎn)生較高滴度的DHV特異性抗體，并對(duì)雛鴨有良好的免疫保護(hù)作用[20]。張婧等構(gòu)建含有Ⅰ型鴨肝炎病毒VP1基因的重組鴨瘟病毒，并初步證實(shí)該重組病毒能夠在真核細(xì)胞中正確表達(dá)DHVI-RVP1基因和綠色熒光蛋白的融合蛋白，為構(gòu)建鴨瘟和鴨病毒性肝炎二價(jià)基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)[21]。

5 小結(jié)

目前，鴨病毒性肝炎主要流行Ⅰ型和Ⅲ型，隨著DHAV-Ⅰ變異株或新型DHAV在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)出現(xiàn)，使得DHAV-Ⅰ免疫失敗也逐漸增多，鴨病毒肝炎多價(jià)疫苗的研究不失為一個(gè)很好的方向。鴨病毒性肝炎弱毒苗效果要優(yōu)于滅活苗，弱毒疫苗仍是下一步研究的重點(diǎn)，隨著基因工程技術(shù)的進(jìn)步，單價(jià)或多價(jià)弱毒基因工程苗也是未來(lái)研究的方向。

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